Nghiên cứu giá trị biểu hiện microRNA trong tuyển chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn (Magnaporthe oryzae)

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu giá trị biểu hiện microRNA trong tuyển chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn (Magnaporthe oryzae)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH NGUYỄN BẰNG PHI NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ BIỂU HIỆN MicroRNA TRONG TUYỂN CHỌN GIỐNG LÚA KHÁNG BỆNH ĐẠO ÔN (Magnaporthe oryzae) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9. 42. 02. 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh, Năm 2023
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH NGUYỄN BẰNG PHI NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ BIỂU HIỆN MicroRNA TRONG TUYỂN CHỌN GIỐNG LÚA KHÁNG BỆNH ĐẠO ÔN (Magnaporthe oryzae) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9. 42. 02. 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. NGUYỄN BẢO QUỐC 2. TS. NGUYỄN NGỌC BẢO CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh, Năm 2023
3. i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Bảo Quốc, TS. Nguyễn Ngọc Bảo Châu đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này; Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đinh Xuân Phát, TS. Nguyễn Vũ Phong, TS. Huỳnh Văn Biết, TS. Lê Thị Diệu Trang đã luôn quan tâm, góp ý xây dựng trong suốt quá trình thực hiện luận án; Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô trong Khoa Khoa Học Sinh Học đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học và thực hành tại Khoa. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu và Phòng Sau Đại Học - Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập; Ban lãnh đạo Trường Đại Học Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia khóa học và thực hiện luận án nghiên cứu này; Tôi xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp và gia đình đã động viên khuyến khích, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường. Tác giả luận án Nguyễn Bằng Phi
4. ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Bảo Quốc và TS. Nguyễn Ngọc Bảo Châu tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực đã được công bố trong các tạp chí, hội nghị khoa học bởi tác giả, nhóm tác giả và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Bằng Phi
5. iii TÓM TẮT NGUYỄN BẰNG PHI – “Nghiên cứu giá trị biểu hiện microRNA trong tuyển chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn (Magnaporthe oryzae)” Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9. 42. 02. 01 Trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, 2015 – 2022. MicroRNAs (miRNAs) là những phân tử RNA có kích thước nhỏ (20-25 nu) đóng vai trò chính trong việc điều hòa cây trồng chống chịu lại các tác nhân sinh học và phi sinh học. Cơ chế của quá trình điều hòa thông qua quá trình làm câm lặng gen ở mức độ phiên mã và sau phiên mã. Trong đó, phân tử osa-miR7695 được mô tả là một microRNA chuyên biệt trên cây lúa với khả năng điều hòa gen đích OsNramp6 làm tăng khả năng chống chịu của cây lúa với nấm gây bệnh đạo ôn (Magnaporthe oryzae) nhờ việc kiểm soát nồng độ của các ion kim loại sắt và các hydroxyl tự do ở cây lúa. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng sự biểu hiện của phân tử osa- miR7695 chỉ xuất hiện trên các giống lúa japonica cũng như vai trò và sự kiểm soát của osa-miR7695 đối với gen đích OsNramp6 cùng tám biến thể phiên mã của chúng trên cây lúa vẫn chưa thật sự rõ ràng. Trong luận văn này, nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá mức độ biểu hiện của một số microRNAs như osa-miR7695, osa- miR169a, osa-miR160a trong việc điều hòa cây lúa chống chịu lại nấm gây bệnh đạo ôn Magnaporthe oryzae tại Việt Nam bằng phương pháp Real-time PCR. Đồng thời, thông qua phương pháp Real-time PCR cùng các công cụ tin sinh học, nghiên cứu đã mô tả đầy đủ vai trò của phân tử osa-miR7695 trong việc điều hòa các biến thể phiên mã của gen OsNramp6 (Natural resistance associated macrophage protein 6) liên quan đến khả năng miễn dịch của cây lúa đối với nấm gây bệnh đạo ôn Magnaporthe oryzae. Kết quả nghiên cứu về mức độ và giá trị biểu hiện của phân tử osa-miR7695 giữa nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae trồng tại Việt Nam cho thấy mức độ biểu hiện của osa-miR7695 trên nhóm lúa chống chịu cao hơn nhóm lúa mẫn cảm từ 2 – 4 lần, ở các thời điểm 24 hpi, 48 hpi, và 72 hpi. Đặc biệt, sự khác biệt cao nhất về mức độ biểu hiện của
6. iv osa-miR7695 tại thời điểm 72 hpi cũng được quan sát và ghi nhận giữa nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm với nấm M. oryzae. Bên cạnh đó, kết quả phân tích đường cong ROC (Receiver Operating Curve) để xác định mức độ nhạy, độ đặc hiệu trong việc phân biệt nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm cho thấy giá trị AUC (area under the curve) là 0,9. Tương tự, kết quả nghiên cứu còn cho thấy osa-miR169a và osa-miR160a có sự gia tăng biểu hiện mang tính khác biệt trên các giống lúa chống chịu với nấm M. oryzae ở các thời điểm lần lượt là 72 hpi và 24 hpi. Điều này cho thấy phương pháp phân biệt nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae dựa trên phân tử chỉ thị osa-miR7695, osa-miR169a và osa-miR160a là rất hiệu quả. Kết quả nghiên cứu vai trò điều hòa của gen đích OsNramp6 cho thấy, có 8 biến thể phiên mã của gen này được mã hóa từ OsNramp6.1 đến OsNramp6.8. Các nghiên cứu trước đây cho rằng osa-miR7695 chỉ ức chế duy nhất 01 biến thể phiên mã OsNramp6.8 (s-Nramp6). Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy osa-miR7695 ức chế biến thể phiên mã OsNramp6.1 và OsNramp6.4. Kết quả cho thấy mức độ biểu hiện của phân tử OsNramp6.1 và OsNramp6.4 tăng cao ở thời điểm 24 hpi, khi so sánh giữa nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm. Mức độ biểu hiện của OsNramp6.1 trên nhóm lúa mẫn cảm gấp 6,5 lần so với nhóm lúa chống chịu; và mức độ biểu hiện của OsNramp6.4 trên nhóm lúa mẫn cảm gấp 3,6 lần so với nhóm lúa chống chịu. Phân tích đường cong ROC của hai biến thể này cho thấy giá trị AUC của OsNramp6.1 và OsNramp6.4 tương ứng bằng 1 và 0,937. Điều này cho thấy phân tử OsNramp6.1 và OsNramp6.4 là các phân tử chỉ thị rất tốt cho việc phân biệt nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae. Bên cạnh đó kết quả phân tích các microRNAs liên quan đến việc điều hòa các biến thể phiên mã OsNramp6 cho thấy có 06 phân tử microRNAs tiềm năng. Trong đó, có 02 microRNAs đã được mô tả chức năng trong việc điều hòa lúa chống lại sự xâm nhiễm nấm M. oryzae là osa-miR159a và osa-miR444a. Từ khóa: Bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae, miRNA, OsNramp6
7. v SUMMARY NGUYEN BANG PHI – “Expression profile of microRNA in selecting rice resisting blast fungus (Magnaporthe oryzae)” Major: Biotechnology Code: 9. 42. 02. 01 Nong Lam University, 2015 – 2022. MicroRNAs (miRNAs) are small RNAs (20-25 nu) regulating plant against biotic and abiotic agents. Mechanism of the microRNA regulation through gene silencing on the transcriptional and post-transcriptional stage. The microRNA osa- miR7695 was described as a rice-specific microRNA in regulating the target gene OsNramp6, leading to increase resistance to rice blast fungus (Magnaporthe oryzae) through controlling iron accumulation and free hydroxyls in rice. Previous studies showed that the expression of the molecule osa-miR7695 is only present in japonica rice varieties, as well as the role of osa-miR7695 in controlling the OsNramp6 target gene and eight transcriptional variants of OsNramp6 is still not clear. Therefore, in this thesis, the study was carried out to evaluate the expression level of some microRNAs in regulating rice resisting to the rice blast fungus (Magnaporthe oryzae) in Viet Nam by Real-time PCR method. Simultaneously, through Real-time PCR method and bioinformatic tools, the study also described the role of osa-miR7695 in regulating transcriptional variants of OsNramp6 (Natural resistance associated macrophage gene protein 6) involving in rice immunity against rice blast fungus, Magnaporthe oryzae. The result of this study on osa-miR7695 expression value between the blast-resistant rice group and the blast-susceptible rice group grown in Viet Nam showed that the expression value of osa-miR7695 in the blast-resistant rice group was 2-4 times higher than in the blast-susceptible rice group, at time points 24 hpi, 48 hpi, and 72 hpi. Particularly, the highest difference of osa-miR7695 expression level at 72 hpi was observed and recorded between blast-resistant rice group and blast-susceptible rice group. In addition, the result of ROC (Receiver Operating Curve) curve analysis to determine the sensitivity, specificity in
8. vi distinguishing blast-resistant rice group and blast-susceptible rice group showed that the AUC value (area under the curve) was 0.9. Similarly, the results showed that osa- miR169a and osa-miR160a expression level increasing in M. oryzae resistant rice group at 72 hpi and 24 hpi, respectively. These results demonstrated that the method based on markers (osa-miR7695, osa-miR169a and osa-miR160a) in distinguishing resistant and susceptible rice groups against M. oryzae was very effective. The results of studying the regulatory role of the OsNramp6 target gene showed that there were 8 transcriptional variants of this gene encoded from OsNramp6.1 to OsNramp6.8, previous studies suggested that osa-miR7695 inhibits only transcriptional variant OsNramp6.8 (s-Nramp6). However, our study showed that osa-miR7695 inhibits transcriptional variants OsNramp6.1 and OsNramp6.4. The results showed that the expression level of OsNramp6.1 and OsNramp6.4 increased at 24 hpi, compared between the blast-resistant rice group and the blast-susceptible rice group. Expression level of OsNramp6.1 in the blast-susceptible rice group was 6.5 times higher than in the blast-resistant rice group; and expression level of OsNramp6.4 in the blast- susceptible rice group was 3.6 times higher than in the blast-resistant rice group. Analyzing ROC curve of two transcriptional variants showed that AUC values of OsNramp6.1 and OsNramp6.4 were 1 and 0.937, respectively. This is meaning that OsNramp6.1 and OsNramp6.4 are good markers for distinguishing blast-resistant and blast-susceptible rice groups. Besides, analysis of microRNAs involving in regulating OsNramp6 transcriptional variants showed that there were 06 potential miRNAs. Of these, two microRNAs were characterized in regulating rice against M. oryzae infection, osa-miR159a and osa-miR444a. Keywords: Magnaporthe oryzae, miRNA, OsNramp6, rice blast
9. vii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii TÓM TẮT iii SUMMARY v MỤC LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH SÁCH CÁC BẢNG xii DANH SÁCH CÁC HÌNH xiii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 2.1. Ý nghĩa khoa học 2 2.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 3. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3 4.1. Đối tượng nghiên cứu 3 4.2. Phạm vi nghiên cứu 3 5. Những đóng góp mới của luận án 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae. 4 1.1.1. Hệ thống miễn dịch của thực vật chống lại tác nhân gây bệnh 7 1.1.2. Tính kháng di truyền của lúa đối với nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae 8
10. viii 1.1.3. Vai trò của các phân tử RNAs nhỏ liên quan đến tính kháng bệnh đạo ôn trên lúa. 10 1.2. Quá trình sinh tổng hợp microRNA ở thực vật 11 1.3. Vai trò và chức năng của các miRNAs làm tăng khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae 15 1.4. Vai trò và chức năng của các miRNAs làm giảm khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae. 18 1.5. Vai trò và chức năng của gen OsNramp6 22 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Nội dung nghiên cứu 25 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25 2.3. Vật liệu nghiên cứu 25 2.4. Phương pháp nghiên cứu 28 2.4.1. Phương pháp xác định và đánh giá khả năng chống chịu với nấm M. oryzae trên các giống lúa thí nghiệm. 28 2.4.2. Phương pháp chiết xuất RNA 30 2.4.3. Phương pháp xác định sự hiện diện của phân tử osa-miR7695 trên các giống lúa thí nghiệm. 31 2.4.4. Phương pháp xác định sự biển hiện của phân tử osa-miR7695, osa- miR169a, osa-miR160a và OsNramp6 trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm. 34 2.4.5. Phương pháp xác định sự biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6 35 2.4.6. Phương pháp xác định microRNA tiềm năng 37 2.4.7. Phương pháp phân tích thống kê 37 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Xác định nấm M. oryzae trên các giống lúa bằng phương pháp PCR. 38
11. ix 3.2. Đánh giá khả năng chống chịu/mẫn cảm với nấm M. oryzae trên các giống lúa thí nghiệm. 46 3.3. Xác định sự hiện diện của phân tử osa-miR7695 trên các giống lúa thí nghiệm. 53 3.4. Đánh giá mức độ biểu hiện của phân tử osa-miR7695 trên các giống lúa thuộc nhóm chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae 65 3.5. Phân tích giá trị biểu hiện của phân tử osa-miR7695 trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae. 69 3.6. Đánh giá biểu hiện của phân tử osa-miR160a trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae. 73 3.7. Đánh giá biểu hiện của phân tử osa-miR169a trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae. 78 3.8. Đánh giá mức độ biểu hiện của OsNramp6 trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae. 85 3.9. Phân tích mức độ và giá trị biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6 ở nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm với nấm M. oryzae. 88 3.10. Nhận diện các microRNAs tiềm năng trong việc điều hòa OsNramp6.1 và OsNramp6.4 ở lúa. 95 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 102 4.1. Kết luận 102 4.2. Đề nghị 102 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104
12. x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA: abscisic acid ACO: 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxydase ARF: auxin responsive factor CDS: Cu/Fe dismustase CIPK10: CBL-interacting serine/threonine-protein kinase 10 DCL1: Dicer-like protein 1 Effector: phân tử tác động EIN: ethylene-insensitive Elicitor: phân tử kích thích. ET: ethylen ETI: effector-triggered immunity GA: gibberellic acid GRF: growth regulating factor Hpi: Hours post innoculation JA: Jasmonate acid Mature miRNA: miRNA trưởng thành MiRNA isoform: miRNA đồng dạng. MITEs: Miniature Inverted-Repeat Transposable Elements NBS-LRR: nucleotide binding site – leucine rich repeats
13. xi NF-YA: nuclear transcription factor Y Nramp6: Natural resistance-associated macrophage protein 6 ORF: open reading frame PAMP: pathogen-associated molecular patterns pre-miRNA: precursor microRNA pri-miRNA: primary microRNA transcript PRRs: pattern regconition receptors PTI: pattern-triggered immunity RDR: RNA Dependent RNA Polymerase Receptor: phân tử thụ quan RISC: RNA induced gene silencing complex RNAi: RNA interference ROS: reactive oxygen species Rpm: rounds per minute SA: Salicylic acid SOD: superoxide dismutase SPL: SQUAMOSA promoter-binding protein-like transcription factor TE: transposable element Transcript variant: biến thể phiên mã UTR: untranslated region.
14. xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách giống lúa sử dụng trong thí nghiệm. 27 Bảng 2. 2. Trình tự đoạn primer sử dụng trong phương pháp Nested RT-PCR 32 Bảng 2.3. Trình tự đoạn primer sử dụng trong phản ứng Real-time PCR (osa- miR7695). 34 Bảng 2.4. Danh sách trình tự các đoạn primer cho phản ứng Real time PCR để xác định sự biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6. 36 Bảng 3. 1. Tỷ lệ phần trăm của vùng nhiễm trên lá lúa gây ra bởi M. oryzae ở 19 giống lúa, sử dụng phần mềm Assess v.2.0. 51 Bảng 3.2. Kết quả đo tỷ lệ A(260/280) của các giống lúa thí nghiệm. 54 Bảng 3.3. Kết quả ly trích RNA tổng số và xử lý DNase I trên các giống lúa. 55 Bảng 3.4. Phân tích biểu đồ hộp giá trị biểu hiện của osa-miR7695 ở nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm ở các thời điểm khác nhau (24 hpi, 48 hpi, 72 hpi) 70 Bảng 3. 5. Kết quả phân tích đường cong ROC osa-miR7695 của nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm 72 Bảng 3.6. Kết quả phân tích biểu đồ hộp (box plot) mức độ biểu hiện của osa- miR160a giữa nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với M. oryzae ở 24 hpi (hpi: hour post innoculation. 77 Bảng 3.7. Phân tích biểu đồ hộp (box plot) mức độ biểu hiện của osa-miR169a giữa nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với M. oryzae ở 72 hpi. 84 Bảng 3.8. Giá trị 2-ΔCt trong biểu đồ hộp (Box plot) thể hiện mức độ biểu hiện của OsNramp6.1 và OsNramp6.4 ở nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm với nấm M. oryzae, thời điểm 24 hpi. 93 Bảng 3.9. Kết quả phân tích thống kê đường cong ROC của OsNramp6.1 và OsNramp6.4 94 Bảng 3.10. Các miRNAs tiềm năng trong việc điều hòa biến thể phiên mã OsNramp6.1, OsNramp6.4 và OsNramp6.8 98
15. xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1. Vòng đời gây bệnh của nấm gây bệnh đạo ôn Magnaporthe spp. bao gồm giai đoạn sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính và giai đoạn lây nhiễm (Dean và ctv., 2005) 5 Hình 1.2. Quá trình gây bệnh của nấm gây bệnh đạo ôn (Were, 2018) 7 Hình 1.3. Hệ thống phòng thủ PTI và ETI trên thực vật (Han và Jung, 2013) 8 Hình 1.4. Quá trình sinh tổng hợp microRNA (Lee và ctv., 2020) 12 Hình 2.1. Trình tự và vị trí bắt cặp của 2 cặp primer (P1,P2) và (P3,P4) trong phản ứng Nested RT-PCR 33 Hình 3.1. Hình thái bào tử của hai mẫu nấm phân lập từ lá và cổ bông biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn. 39 Hình 3.2. Sự hình thành các cấu trúc xâm nhiễm của mẫu nấm gây bệnh đạo ôn phân lập được sau các thời gian quan sát khác nhau. (c) bào tử, (g) nảy mầm, (a) giác bám (appressorium). 40 Hình 3.3. Tính chuyên biệt của cặp primer Pot2 tranposon trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn và trong chẩn đoán bệnh đạo ôn trên đồng ruộng. 43 Hình 3.4. Kết quả BLAST trình tự DNA sản phẩm PCR bằng cặp primer Pot2 transposon của mẫu nấm gây bệnh đạo ôn phân lập từ lá lúa nhiễm bệnh tại Đồng Nai (LĐN) và lá lúa biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn trên cơ sở dữ liệu DNA của NCBI. 44 Hình 3.5. Kết quả BLAST trình tự DNA sản phẩm PCR bằng cặp primer Pot2 transposon của mẫu nấm gây bệnh đạo ôn phân lập từ lá lúa nhiễm bệnh đạo ôn (LN) và lá lúa biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn trên cơ sở dữ liệu DNA của NCBI. 45 Hình 3.6. Kết quả chủng bệnh nấm M. oryzae LBT2 trên lá của 10 giống lúa. 47 Hình 3.7. Trạng thái của cây lúa trước khi chủng bệnh ở hai giống thử nghiệm. (a) J-short; (b) OM6162 48 Hình 3.8. Sự sinh trưởng của cây lúa ở 20 giống nghiên cứu sau 14 ngày trồng. 49 Hình 3.9. Kết quả chủng bệnh nấm M. oryzae LBT2 trên lá của giống IR50404 50
16. xiv Hình 3.10. Kết quả điện di thử nghiệm trên giống lúa J-short (giống japonica) 57 Hình 3.11. Kết quả điện di của gen đối chứng nội OsUbi1 trên các giống lúa 58 Hình 3.12. Kết quả điện di phản ứng PCR1 sử dụng cặp đoạn primer (P1,P2) 59 Hình 3.13. Kết quả điện di phản ứng PCR2 sử dụng cặp primer (P3,P4) 60 Hình 3.14. Kết quả điện di xác định sự hiện diện của osa-miR7695 trên 19 giống lúa. 60 Hình 3.15. Kết quả giải trình tự của LpJET1.2 chứa trình tự của phân tử precursor osa-miR7695. 62 Hình 3.16. Kết quả cloning và giải trình tự của phân tử precursor osa-miR7695 (487bp). 63 Hình 3.17. Kết quả phân tích BLAST (osa-miR7695) với dữ liệu miRBase. 64 Hình 3.18. Mức độ biểu hiện của osa-miR7695 trên một số giống lúa đại diện cho hai nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae. 66 Hình 3.19. Mức độ biểu hiện của microRNA osa-miR7695 ở 19 giống lúa trồng ở Việt Nam. Mức độ khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm chống chịu và mẫn cảm ( tương đương P ≤ 0,01; hpi: giờ sau lây nhiễm). 68 Hình 3.20. Biểu đồ hộp mô tả biểu hiện của osa-miR7695 ở 19 giống lúa chống chịu và mẫn cảm. Mức độ khác biệt có ý nghĩa thống kê ( : P< 0,01; hpi: giờ sau lây nhiễm) 70 Hình 3. 21. Đường cong ROC (Receiver operator characteristic) thể hiện độ nhạy và độ đặc hiệu của giá trị 2-ΔCt (osa-miR7695) trong việc phân biệt nhóm giống lúa chống chịu và mẫn cảm.Diện tích bên dưới đường cong (AUC) là 0,899. 72 Hình 3.22. Kết quả mức độ biểu hiện của osa-miR160a trên các giống lúa thuộc nhóm chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae. 75 Hình 3. 23. Biểu đồ hộp (box plot) các giá trị biểu hiện của osa-miR160a trên 10 giống lúa thuộc hai nhóm chống chịu và mẫn cảm với M. oryzae ở các thời điểm sau lây nhiễm khác nhau (24, 48 và 72 hpi). Dấu * chỉ mức độ khác biệt có ý ghĩa về mặt thống kê giữa 2 nhóm lúa (P < 0,05). 76
17. xv Hình 3.24. Mức độ biểu hiện của osa-miR169a trên các giống lúa thuộc nhóm chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae (hpi: giờ sau lây nhiễm) 81 Hình 3.25. Biểu đồ hộp (box plot) các giá trị biểu hiện của osa-miR169a trên 12 giống lúa thuộc hai nhóm chống chịu và mẫn cảm với M. oryzae ở các thời điểm sau nhiễm khác nhau (0, 24, 48 và 72 hpi). Dấu chỉ mức độ khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa 2 nhóm lúa (P ≤ 0,01). 83 Hình 3.26. Biểu hiện của gen OsNramp6 ở 06 giống lúa tiêu biểu (03 giống lúa chống chịu, 03 giống lúa mẫn cảm). 87 Hình 3.27. Cấu trúc gen của các biến thể phiên mã OsNramp6 và vị trí thiết kế primer realtime-PCR. 89 Hình 3.28. Mức độ biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6 giữa nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae trồng ở Việt Nam, ở các thời điểm nhiễm nấm M.orzyae khác nhau. Mức độ ý nghĩa thống kê, P ≤ 0,01 ( ), P ≤ 0,05 (*); hpi: giờ sau nhiễm. 91 Hình 3.29. Biểu đồ hộp (Box plot) thể hiện mức độ biểu hiện của biến thể phiên mã OsNramp6.1 và OsNramp6.4 của 08 giống lúa trồng ở Việt Nam, thời điểm 24 hpi. Mức độ ý nghĩa P ≤ 0,01 ( ), P ≤ 0,05 (*). 92 Hình 3. 30. Đường cong ROC của OsNramp6.1 và OsNramp6.4. Diện tích dưới đường cong (AUC) của OsNramp6.1 và OsNramp6.4 tương ứng là 1 và 0,937 (P ≤ 0,05) 94 Hình 3.31. Sơ đồ vị trí bắt cặp của 06 microRNA tiềm năng trên 03 biến thể phiên mã OsNramp6.1, OsNramp6.4 và OsNramp6.8 97
18. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh đạo ôn là bệnh do nấm Magnaporthe oryzae gây ra, phân bố rộng khắp các vùng trồng lúa, đặc biệt là những nơi có khí hậu ôn hòa, độ ẩm cao, gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất lúa (Sharma và ctv., 2012). Các nghiên cứu về tính kháng với nấm M. oryzae gây hại trên lúa đã được tiến hành từ những năm đầu thập niên thế kỷ 17, và trong vòng hai thập niên gần đây thì các nghiên cứu về lúa kháng nấm M. oryzae đã được tiến hành rất mạnh mẽ. Bên cạnh các nghiên cứu về gen kháng nấm M. oryzae thì các nghiên cứu về sự biểu hiện của microRNA nổi lên như một dấu ấn sinh học giúp phân biệt tính kháng đối với nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa. Nghiên cứu gần đây của Campo và ctv. (2013) đã chỉ ra rằng sự biểu hiện gia tăng osa-miR7695 có liên quan đến kháng nấm M. oryzae trên lúa. Trong đó, osa-miR7695 kiểm soát sự biểu hiện của gen đích OsNramp6 (Os01g31870) vốn liên quan đến hệ miễn dịch của cây lúa trong việc chống chịu sự xâm nhiễm của nấm M. oryzae, cụ thể là osa-miR7695 điều hòa 02 biến thể phiên mã OsNramp6.1 (s-Nramp6) và OsNramp6.8 (l-Nramp6) (Campo và ctv., 2013, Peris-Peris và ctv., 2017). Hơn thế nữa, bên cạnh phân tử osa-miR7695 còn có rất nhiều phân tử microRNAs khác như: osa-miR169a, osa-miR162a, osa-miR164a, osa-miR398b, osa-miR168, osa-miR398, osa-miR167d, osa-miR160a v.v được mô tả là có liên quan đến hệ miễn dịch của cây lúa chống chịu với sự xâm nhiễm của nấm M. oryzae. Ở Việt Nam, công tác nghiên cứu, phát triển các giống lúa có khả năng kháng cao và bền vững đối với bệnh đạo ôn vẫn đang được chú trọng và cần những giải pháp hiệu quả về mặt sinh học phân tử. Đánh giá mức độ biểu hiện của các phân tử miRNAs cùng các gen mục tiêu đích của nó hứa hẹn trong việc đưa ra một cái nhìn toàn cảnh về vai trò của các RNA ngắn không mã hóa đối với sự đáp ứng miễn dịch của cây lúa, đồng thời cũng là một triển vọng để ứng dụng các phân tử microRNAs và các gen mục tiêu này như là một công cụ hỗ trợ cho việc xác định và phân biệt các nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae, phục vụ cho công tác lai tạo và đánh giá khả năng chống chịu của các giống lúa tại Việt Nam hiện nay. Từ những cơ sở nêu trên, đề tài “Nghiên cứu
19. 2 giá trị biểu hiện microRNA trong tuyển chọn giống lúa kháng bệnh đạo ôn (Magnaporthe oryzae)” đã được tiến hành. 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2.1. Ý nghĩa khoa học Góp phần xác định sự hiện diện và vai trò của osa-miR7695 đối với tính kháng nấm gây bệnh đạo ôn (Magnaporthe oryzae) trên giống lúa (Oryza sativa L.) ở Việt Nam. Khái quát rõ và đầy đủ hơn về mối tương tác giữa các biến thể phiên mã gen OsNramp6 với hệ thống các phân tử miRNAs trên cây lúa. Góp phần hỗ trợ công tác phân biệt và lai tạo giống lúa chống chịu nấm gây bệnh đạo ôn (Magnaporthe oryzae) trên cây lúa (Oryza sativa L.). Tạo tiền đề cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng miRNA không chỉ trên nấm M. oryzae mà còn trên các tác nhân gây bệnh khác. 2.2. Ý nghĩa thực tiễn Góp phần xây dựng các dữ liệu khoa học nhằm đánh giá giống lúa chống chịu nấm gây bệnh đạo ôn (M. oryzae) thông qua phân tử osa-miR7695 hoặc các biến thể phiên mã của gen OsNramp6. Đây là một cách tiếp cận của di truyền biểu sinh dựa trên sự biểu hiện của các phân tử miRNAs trong công tác nghiên cứu các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn. 3. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Xác định sự hiện diện của osa-miR7695 trên các giống lúa japonica và indica. Phân tích mức độ và giá trị biểu hiện của osa-miR7695, osa-miR160a và osa- miR169a trên nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm trồng tại Việt Nam. Xác định mối liên hệ giữa phân tử osa-miR7695 và các biến thể phiên mã của gen đích OsNramp6.
20. 3 Phân tích mức độ và giá trị biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6 trên nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm trồng tại Việt Nam. Dự đoán, tìm kiếm các microRNAs khác ngoài osa-miR7695 trong việc tác động đến các biến thể phiên mã của gen đích OsNramp6. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các phân tử osa-miR7695, osa-miR169a, osa-miR160a và OsNramp6 liên quan đến khả năng chống chịu nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu giới hạn trong việc phân tích giá trị và mức độ biểu hiện của các phân tử osa-miR7695, osa-miR169a, osa-miR160a và OsNramp6, để từ đó góp phần hỗ trợ cho công tác lai tạo giống lúa chống chịu nấm gây bệnh đạo ôn. Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm và thực hiện chủng bệnh trên cây lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm 5. Những đóng góp mới của luận án Xác định được sự hiện diện của osa-miR7695 trên giống lúa indica. Phân tích so sánh mức độ và giá trị biểu hiện của osa-miR7695 và osa- miR169a, osa-miR160a trên nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm trồng tại Việt Nam. Đánh giá được mức độ và giá trị biểu hiện của hai biến thể OsNramp6.1 và OsNramp6.4 phù hợp cho việc làm chỉ thị sinh học cho tính kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa. Mô tả một cách đầy đủ về sự tương tác của biến thể phiên mã OsNramp6.1, OsNramp6.8 với một số phân tử miRNAs trên lúa.
21. 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae. Trong những năm qua, tác nhân gây bệnh đạo ôn trên lúa có nhiều tên gọi khác nhau. Giai đoạn vô tính của nấm gây bệnh đạo ôn được Saccardo đặt tên là Pyricularia grisea vào năm 1880 và sau đó được Cavara đặt tên là Pyricularia oryzae vào năm 1892. Trong giai đoạn hữu tính tên gọi của nấm gây bệnh đạo ôn lại được đặt tên là Magnaporthe grisea (Hebert) Barr vào năm 1970 và nhanh chóng được đổi tên thành Magnaporthe oryzae (Couch và Kohn, 2002; Zhang và ctv., 2016b). Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng Pyricularia oryzae được xem là cách đặt tên chính xác cho tác nhân gây bệnh đạo ôn trên lúa ở cả giai đoạn vô tính và hữu tính do khả năng gây bệnh và các đặc điểm sinh thái, tiến hóa của nấm gây bệnh đạo ôn (Moreira và ctv., 2015; Zhang và ctv., 2016b). Tuy nhiên, tên đồng nghĩa với nấm Pyricularia oryzae là Magnaporthe oryzae được khuyến nghị sử dụng thống nhất chung cho tác nhân này trong các công bố khoa học (Zhang và ctv., 2016b). Quá trình gây bệnh của nấm M. oryzae bao gồm hai giai đoạn là sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô tính, thời gian từ lúc bắt đầu tiếp xúc với lá lúa đến lúc phát tán bào tử kéo dài khoảng 1 tuần. Giai đoạn sinh sản hữu tính rất ít khi gặp trên đồng ruộng hoặc trên cây ký chủ, tuy nhiên giai đoạn sinh sản hữu tính có thể được tạo ra trong ống nghiệm trong trường hợp hai mẫu nấm phân lập có kiểu giao phối tương thích và được bắt cặp với nhau (Hình 1.1). Trong giai đoạn vô tính (anamorphic) thường tìm thấy trên đồng ruộng, P. oryzae hình thành bào tử với hình dạng đặc trưng quả lê, hình trứng. Bào tử có hai vách ngăn với đáy hình tròn, đỉnh mỏng, màu hơi sẫm hoặc vàng nhạt và có một rốn hạt nhỏ ở góc gắn với cuống bào tử (conidiophore) (Counch và Kohn, 2002). Ở giai đoạn hữu tính (telemorphic) thường không quan sát được trong tự nhiên và chỉ được thực hiện bằng cách ghép đôi các cá thể tương thích trong ống nghiệm (Moreira và ctv, 2015). Nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa cũng được xem là tác nhân bán sinh dưỡng (hemibiotrophic). Đây là một phương thức tồn tại mà trong đó nấm bắt đầu ở giai
22. 5 đoạn sinh dưỡng khi hệ miễn dịch của thực vật bị ức chế và sau đó là chuyển sang giai đoạn hoại tử nơi thúc đẩy quá trình chết của tế bào (Fernandez và Orth, 2018). Hình 1.1. Vòng đời gây bệnh của nấm gây bệnh đạo ôn Magnaporthe spp. bao gồm giai đoạn sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính và giai đoạn lây nhiễm (Dean và ctv., 2005). Các tác nhân gây bệnh trên cây trồng luôn tiến hóa liên tục nhằm vượt qua những rào cản của hệ miễn dịch thực vật (Fernandez và Orth, 2018; Vale và ctv., 2001). Như mô tả ở Hình 1.2, nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae bắt đầu xâm nhiễm bằng cách hình thành bào tử bám trên trên bề mặt kỵ nước của lá và sau đó nảy mầm, hình thành các cấu trúc xâm nhiễm như giác bám (appressoria), ống xâm nhiễm (penetration peg) (Martin-Urdiroz và ctv., 2016). Ống mầm (germ tube) sau khi hình thành từ bào tử sẽ nhận biết bề mặt lá và hình thành giác bám để từ đó giúp nấm M. oryzae xâm nhiễm vào tế bào thực vật thông qua tác động của lực trương cơ học và các enzyme phân hủy thành tế bào (Fernandez và Orth, 2018; Martin-Urdiroz và ctv., 2016; Nguyen và ctv., 2011; Vu và ctv., 2012; Yan và Talbot, 2016). Các ống xâm nhiễm sẽ hình thành và tấn công vào các tế bào của thực vật theo cả chiều dọc và chiều ngang (Nguyen và ctv., 2011). Sự tương tác này xảy ra trong các tế bào biểu bì và trung bì dẫn đến sự xâm nhiễm mô và hình thành các vết thương rõ ràng trên lá sau khi nhiễm 72 giờ (Martin-Urdiroz và ctv., 2016). Sự xâm nhiễm này phụ thuộc vào điều kiện môi trường và khí hậu thuận lợi cho nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae.
23. 6 Thông thường nhiệt độ khoảng 25 0C – 28 0C là nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm của bào tử và xâm nhiễm (Filippi và ctv., 2011). Sự xuất hiện và phát triển của nấm gây bệnh đạo ôn cũng tăng lên khi ẩm độ không khí trên 90%, mây mù hoặc bón quá nhiều đạm là các nguyên nhân tạo điều kiện cho mầm bệnh hình thành và phát triển (Prabhu và ctv., 2009). Các triệu chứng do nấm M. oryzae gây ra trên lúa thường được quan sát và ghi nhận trên lá, bẹ lá, cổ lá, chùy, cuống và hạt (Ribot và ctv., 2008). Triệu chứng gây bệnh của nấm M. oryzae bắt đầu từ các đốm hoại tử nhỏ màu nâu xuất hiện trên lá và phát triển thành hình elip với rìa màu nâu và màu xám hoặc trắng (Agbowuro và ctv., 2020). Theo thời gian, những tổn thương này tăng kích thước theo hướng các mạch lá và khi nhiễm nặng sẽ xuất hiện quầng vàng bao quanh vết nhiễm cho đến khi mô chết (Agbowuro và ctv., 2020). Do đó, nấm M. oryzae sẽ gây ra những tác động nghiêm trọng trên cây lúa như làm giảm năng suất hạt do tác động trực tiếp của việc ngăn chặn sự dịch chuyển chất dinh dưỡng làm cho hạt kém hình thành hoặc thậm chí làm bông lúa bất thụ (Prabhu và Filippi, 1995). Ở giai đoạn sinh dưỡng của lúa, nấm M. oryzae sẽ làm ảnh hưởng đến tầm vóc và số lượng đẻ nhánh của cây làm ảnh hưởng đến năng suất (Ribot và ctv., 2008). Thông thường bệnh đạo ôn ở cổ bông sẽ gây ra thiệt hại lớn nhất về năng suất hạt gạo trong quá trình xâm nhiễm (Filippi và ctv., 2011). Nhìn chung, không thể loại trừ hoàn toàn bệnh đạo ôn trên đồng ruộng nhưng có thể giảm đáng kể những thiệt hại do bệnh gây ra thông qua biện pháp quản lý cây trồng tổng hợp (Prabhu và ctv., 2009). Việc lạm dụng các loại thuốc diệt nấm để kiểm soát nấm gây bệnh đạo ôn trên đồng ruộng là một mối nguy hiểm tiềm ẩn đối với sức khỏe và môi trường, dễ dẫn đến hình thành các chủng nấm gây bệnh đạo ôn kháng thuốc (Maciel, 2018; Srivastava và ctv., 2017). Do đó, xu hướng sử dụng các giống lúa chống chịu với nấm M. oryzae và quản lý trồng trọt tốt trên đồng ruộng được xem là giải pháp mang tính bền vững hiện nay (Filippi và ctv., 2011).
24. 7 Hình 1.2. Quá trình gây bệnh của nấm gây bệnh đạo ôn (Were, 2018) Chú thích: [A] Bào tử nấm gây bệnh đạo ôn gắn vào bề mặt [B] Nảy mầm của bào tử, bằng cách tạo ra một ống mầm (germ tube), phần trên đỉnh của ống mầm hình thành một cái móc, mục đích để cảm nhận các đặc tính hóa học và vật lý của bề mặt. [C] Hình thành tế bào xâm nhiễm(appressoria cell).Một lớp melanin hình thành bên trong vách tế bào xâm nhiễm.[D] Bằng cách sử dụng áp lực trương phồng, một cái chốt/ống của nấm gây bệnh đạo ôn được đẩy xuyên qua lớp cutin của lá. [E] Hình thành hệ sợi nấm ban đầu. [F] Hệ sợi nấm xâm chiếm toàn bộ các mô. [G] Phá vỡ tế bào ra thoát ra. 1.1.1. Hệ thống miễn dịch của thực vật chống lại tác nhân gây bệnh Ở cây trồng có hai hệ thống phòng thủ thuộc hệ thống miễn dịch là PTI (pathogen-associated molecular pattern triggered immunity) và ETI (effector triggered immunity) (Weiberg và Jin, 2015). Hệ thống thứ nhất là PTI, được hoạt hóa khi các phân tử elicitors trên nấm M. oryzae tiếp xúc với các phân tử receptors trong hệ thống miễn dịch PTI dẫn đến hệ thống PTI ức chế sự xâm nhiễm của nấm M. oryzae (Weiberg và ctv., 2014). Tuyến phòng thủ đầu tiên này bao gồm các thụ thể có ở màng sinh chất đóng vai trò nhận diện các yếu tố mầm bệnh và kích hoạt phản ứng phòng vệ. Các yếu tố gây bệnh là các phân tử liên kết với mầm bệnh (PAMPs) được bảo tồn và là các phân tử đặc hiệu, có tính vi sinh vật cao. Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRRs) nhận diện PAMP thông qua vùng ngoại bào lặp lại giàu leucine (LRRs) và các protein kinase nội bào. Khi nhận diện PAMP, các thụ thể PRRs tạo ra một dòng tín hiệu xuôi dòng bao gồm sản xuất các chất có tính oxy hóa (ROS)
25. 8 cảm ứng các protein kinase phụ thuộc canxi (CDPK), protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK), phytohormones và kích thích tố báo hiệu (axit jasmonic, axit salicylic, ethylene). Tuy nhiên, nấm M. oryzae có thể tấn công hệ thống miễn dịch PTI thông qua vai trò của các effectors. Và các gen kháng (R gene) trên cây trồng tạo ra các protein có khả năng nhận biết các effectors để kích hoạt hệ thống ETI kháng nấm gây bệnh đạo ôn (Katiyar-Agarwal và Jin, 2007). Các phân tử effectors được mã hóa bởi các gen không độc (avirulence genes) ở nấm M. oryzae, còn gen kháng (R gene) ở lúa mã hóa các phân tử protein bắt giữ các phân tử effectors của nấm M. oryzae (Padmanabhan và ctv., 2009) (Hình 1.3). Hình 1.3. Hệ thống phòng thủ PTI và ETI trên thực vật (Han và Jung, 2013) 1.1.2. Tính kháng di truyền của lúa đối với nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực rất quan trọng trong nông nghiệp và cũng là cây trồng có bộ gen (genome) được giải trình tự hoàn toàn cũng như được sử dụng là mô hình nghiên cứu trong các cây cùng họ (Arumuganathan và Earle, 1991). Bộ gen của cây lúa có khoảng 430 triệu bp, ước tính khoảng 46 đến 56 nghìn gen cho nhóm lúa indica và khoảng 32 đến 50 nghìn gen cho nhóm lúa japonica (Chiu và ctv., 2002; Goff và ctv., 2002; Hori và ctv., 2017; Project, 2007). Thông tin này
26. 9 rất có ý nghĩa cho việc tìm hiểu các cơ chế phân tử chi phối tính kháng di truyền đối với các tác nhân gây bệnh trên lúa, đặc biệt là nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae. Bộ gen của nấm gây bệnh đạo ôn cũng mã hóa hàng trăm effectors có liên quan đến tính kháng của lúa. Một số effectors được nhận biết bởi các thụ thể miễn dịch nội bào thuộc liên kết nucleotide lặp lại giàu leucine (NLR) (De la Concepcion và ctv., 2021; Stein và ctv., 2018). Thực vật có khả năng hình thành rất nhiều dạng NLRs để vô hiệu hóa các yếu tố độc lực hay các effectors được tiết ra từ các tác nhân gây bệnh (De la Concepcion và ctv., 2021). Sau khi phát hiện mầm bệnh, NLR sẽ kích hoạt các phản ứng miễn dịch có khả năng làm gián đoạn sự lây lan của mầm bệnh. Cấu trúc của NLR ở thực vật bao gồm các miền tích hợp không chính thức (integrated non-canonical domains). Các miền tích hợp này đóng vai trò như primer bẫy để phát hiện mầm bệnh (Stein và ctv., 2018; De la concepcion và ctv., 2021). Các thụ thể NLRs mang các miền tích hợp này sẽ chịu trách nhiệm cho một số gen kháng bệnh đạo ôn (De la Concepcion và ctv., 2021). Tuy nhiên, cơ chế này cuối cùng lại thúc đẩy sự phát triển của các biến thể effectors mới thoát khỏi sự phát hiện của hệ miễn dịch thực vật. Vì lý do này, việc sử dụng thông tin NLR trong các bộ gen tham chiếu sẽ là cơ hội lớn cho các chương trình cải tiến cây trồng. Trong một nghiên cứu sử dụng 13 bộ gen tham chiếu của các loài Oryza, 5,408 gen NLR đã được xác định trong đó có 535 gen NLR được phát hiện trên các giống lúa thuộc nhóm indica (Oryza sativa vg. indica) (Stein và ctv., 2018). Để tìm ra các gen kháng liên quan đến nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, các nhà khoa học thường tìm hiểu thông qua vị trí các gen tính trạng số lượng QTL (Quantitative trait loci). Hiện nay, có khoảng 350 QTL được biết là có liên quan đến tính kháng của cây lúa và có khoảng 85 QTL đã được mô tả rõ ràng (Ashkani và ctv., 2016; Srivastava và ctv., 2017). Các QTL đầu tiên liên quan đến tính kháng bệnh đạo ôn đã được đánh dấu bởi Wang và ctv. (1994) và kể từ đó, việc tìm kiếm các QTL ngày càng tăng nhằm hỗ trợ cho việc tạo khả năng kháng nấm M. oryzae trên lúa bền vững hơn (Ashkani và ctv., 2016). Số lượng QTL nhiều sẽ có nghĩa là có nhiều nguồn kháng một phần và giúp làm giảm sự lây lan của mầm bệnh, giữ áp lực chọn lọc thấp
27. 10 trong quần thể nấm gây bệnh đạo ôn (M. oryzae) và duy trì khả năng kháng bệnh đạo ôn lâu bền trên lúa (Maciel, 2018; Sharma và ctv., 2012). QTL được sử dụng để xác định các gen kháng thuốc và cũng để phát triển các dấu hiệu liên quan đến các gen này. Đối với tính kháng bệnh đạo ôn ở lúa, các QTL có hiệu quả chống lại một số chủng M. oryzae đã được xác định, và hầu hết đều liên quan đến các gen định tính (Srivastava và ctv., 2017). Một số QTL đã được sử dụng để tạo hình tháp gen (Sharma và ctv. 2012). 1.1.3. Vai trò của các phân tử RNAs nhỏ liên quan đến tính kháng bệnh đạo ôn trên lúa. Các phản ứng miễn dịch của thực vật được kiểm soát chặt chẽ bởi các yếu tố điều hòa như các yếu tố phiên mã và các phân tử RNAs nhỏ (Deng và ctv., 2018). Các phân tử RNAs nhỏ nội sinh trong thực vật bao gồm miRNA và siRNA. Cả hai phân tử này đều được hình thành từ hoạt động phân cắt của protein Dicer (DCL) và sau đó chúng kết hợp với các protein ARGONAUTE (AGO) để tạo thành các phức hợp làm câm lặng gen do RNA gây ra (RISC) (Baulcombe, 2004). Các phức hợp RISCs này sẽ liên kết cụ thể với trình tự DNA hoặc RNA thông tin của các gen mục tiêu và kìm hãm sự biểu hiện của chúng ở mức độ phiên mã, sau phiên mã hoặc dịch mã thông qua quá trình methyl hóa DNA, phân cắt mRNA hoặc kiềm hãm quá trình dịch mã (Brodersen và ctv., 2008; Llave, 2004; Song và ctv., 2019; Wu và ctv., 2010). Các nghiên cứu gần đây cho thấy RNA nhỏ (bao gồm microRNA, siRNA và piRNA) đóng vai trò chính trong việc điều hòa hệ thống PTI và ETI ở cây trồng (Fu và ctv., 2006; Khraiwesh và ctv., 2012). Giữa cây trồng và nấm M. oryzae tương tác với nhau thông qua phân tử RNA nhỏ (small RNA), từ đó tạo ra một cuộc cạnh tranh để kiểm soát quyền điều khiển hệ thống miễn dịch thông qua RNA nhỏ (Weiberg và Jin, 2015). Nấm M. oryzae có thể kiểm soát hệ thống PTI và ETI thông qua microRNA, và ngược lại lúa cũng có thể ngăn cản sự xâm nhiễm của nấm M. oryzae thông qua microRNA (Baldrich và ctv., 2015; Li và ctv., 2019b; Zuo và ctv., 2014).
28. 11 Các nghiên cứu ứng dụng siRNA trong việc tạo các giống lúa chống chịu cũng được thực hiện bằng phương pháp ức chế gen thông qua ký chủ (host induced gene silencing – HIGS). Phương pháp HIGS đã được mô tả thành công trong việc phòng chống sự xâm nhiễm của nấm bệnh Puccinie striiformis sp.tritci (Chen và ctv., 2014), nấm Fusarium graminearum (Cheng và ctv., 2015), nấm Blumeria graminis (Pliego và ctv., 2013), nấm Puccinia triticina (Panwar và ctv., 2013). Trên lúa, phương pháp HIGS cũng đã được nghiên cứu và tiến hành thành công nhằm tạo ra cây lúa có khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn một cách bền vững (Guo và ctv., 2019). Hầu hết các nghiên cứu sử dụng HIGS để kháng nấm gây bệnh đạo ôn đều tập trung vào các gen gây độc hoặc các gen tham gia vào quá trình phát triển của nấm M. oryzae. Ví dụ như gen PLS1 (plastin1) liên quan đến quá trình điều hòa tế bào xâm nhiễm (Clergeot và ctv., 2001), gen MPG1(mannose-1-phosphate guanyltransferase) mã hóa cho hydrophobin giúp nấm gây bệnh đạo ôn tương tác trên bề mặt vật chủ (Talbot và ctv., 1996), gen PMK1(Mitogen-activated protein kinase pmk-1) điều hòa sự xâm nhiễm và phát triển hệ sợi nấm gây bệnh đạo ôn (Xue và ctv., 2002), gen RVS167 (amphiphysin) và gen Las17 (Proline-rich protein) điều hòa sự xâm nhiễm của tế bào giác bám (Dagdas và ctv., 2012; Penn và ctv., 2015), gen MoAP1 (modulator of apoptosis 1) mã hóa nhân tố phiên mã bZIP trong quá trình hình thành bào tử đính của nấm gây bệnh đạo ôn, điều hòa sự phát triển sợi nấm và cả tính gây bệnh của nấm gây bệnh đạo ôn (Guo và ctv., 2011; Guo và ctv., 2019). Tóm lại, phân tử RNA nhỏ (bao gồm microRNA, siRNA, piwiRNA) đóng vai trò rất quan trọng trong việc điều hòa cây lúa sinh trưởng, phát triển và chống chịu với các tác nhân sinh học và phi sinh học (Khraiwesh và ctv., 2012; Tang và Chu, 2017) 1.2. Quá trình sinh tổng hợp microRNA ở thực vật MicroRNAs là những đoạn RNA nhỏ có kích thước 20-25 nu, sợi đơn, có tác dụng điều hòa gen ở giai đoạn phiên mã và sau phiên mã (Hình 1.4). Kể từ sau khi phát hiện ra miRNA vào năm 1993 thì hàng loạt miRNAs khác nhau ở thực vật và động vật đã được phát hiện (Voinnet, 2009). Đồng thời, các nghiên cứu về cơ chế
29. 12 hình thành miRNA, và sự tác động lên mRNA đích cũng đã được nghiên cứu và hiểu một cách rõ ràng. Hình 1.4. Quá trình sinh tổng hợp microRNA (Lee và ctv., 2020) Chú thích: Các phân tử microRNA được phiên mã bởi enzyme RNA polymerase II từ gen MIR tạo ra pri-miRNA (chứa đuôi poly A). Tiếp đó, pri-miRNA được cắt bằng enzyme ribonuclease III (Drosha) thành tiền phân tử microRNA (precursor-miRNA) có chiều dài khoảng 70 nt thân cuộn vòng. Sau đó, phân tử precursor-miRNA sẽ được vận chuyển ra ngoài tế bào chất nhờ protein Exportin-5 và được cắt bằng enzyme ribonuclease (Dicer), tạo thành phân tử microRNA trưởng thành (mature miRNA). Phân tử miRNA trưởng thành này tiếp tục gắn với phức hợp câm lặng gen (RISC) để nhận biết các phân tử mRNA đích thông qua việc bắt cặp không hoàn hảo với sợi miRNA khuôn mẫu (sợi miRNA hoạt động) và dẫn đến kết quả là ức chế quá trình phiên mã hoặc ngăn chặn quá trình dịch mã. Trên cây trồng, phân tử miRNA được tạo thành từ tiền phân tử miRNAs (precursor miRNA) với các cấu trúc thân vòng (dài khoảng 70 nu) và được phân cắt bởi enzyme RNaseIII là Dicer-like 1 (DCL1) tạo thành các sợi đôi miRNA-miRNA*, trong đó có 1 sợi đơn hoạt động (guide strand miRNA) và 1 sợi đơn bị thoái biến (passenger strand miRNA*). Sợi đơn miRNA hoạt động sẽ kết hợp với phức hợp câm lặng gen (RISC) để hình thành nên phức hợp ức chế gen (RISC – RNA induced gene silencing) tham gia vào quá trình ức chế gen sau phiên mã (bằng cách cắt đoạn mRNA
30. 13 đích) hoặc ức chế quá trình dịch mã (bằng cách ngăn chặn sự hình thành 80S ribosome từ 2 tiểu đơn vị 40S và 60S) (Brodersen và ctv., 2008; Gu và Kay, 2010). Phân tử miRNA được phiên mã từ gen tạo ra miRNA (MIR gene), yếu tố gen nhảy hoặc vùng giữa gen (intergenic region) (Qin và ctv., 2015). Hầu hết các loài cây đều sở hữu trên 100 gen tạo ra miRNA và có riêng đơn vị phiên mã (transcription unit) gắn với gen MIR (Griffiths-Jones và ctv., 2008). Các gen MIRs này thường nằm ở vị trí giữa hai gen chức năng (intergenic genes) (Rhoades và ctv., 2002). Gen MIR được phiên mã nhờ enzyme RNA polymerase II (Pol II) tạo thành pri-miRNA, phân tử pri-miRNA được bảo vệ bằng cách gắn mũ 7-methylguanosine ở đầu 5’ (Xie và ctv., 2005) và gắn đuôi polyA ở đầu 3’ (Mallory và ctv., 2004). Tham gia vào việc phân cắt precursor miRNAs có rất nhiều Dicer-like protein (DCL) tạo thành một họ DCL. Các loại DCLs khác nhau sẽ tạo ra miRNA có kích thước khác nhau, ví dụ như: DCL1 và DCL4 tạo miRNA có kích thước 21 nu, DCL2 tạo ra miRNA kích thước 22 nu, và DCL3 tạo miRNA kích thước 24 nu (Rogers và Chen, 2013). Ở thực vật, DCL1 đóng vai trò chính trong việc tạo miRNA, do vậy phần lớn miRNAs ở thực vật có kích thước 21 nu (Rogers và Chen, 2013; Voinet, 2009). DCL1 có vai trò rất quan trọng trong quá trình điều hòa các quá trình sinh lý ở cây trồng. Đột biến mất chức năng DCL1 ở cây Arabidopsis thaliana làm chết phôi (Fukudome và Fukuhara, 2017). Mỗi loại enzyme DCL(1-4) có vai trò khác nhau trong quá trình điều hòa cây trồng chống chịu lại các tác nhân sinh học và phi sinh học (Voinnet, 2009). Đồng thời, các enzyme DCLs có sự phân tầng về chức năng ở các mô khác nhau của cây trồng, điều này cũng cho thấy các phân tử DCLs điều hòa quá trình tạo ra miRNA tùy theo không gian và thời gian (Rogers và Chen, 2013). Ở lúa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh miRNA đóng vai trò trong việc điều hòa các quá trình sinh dưỡng và các đáp ứng với tác nhân gây bệnh (Song và ctv., 2019; Xie và ctv., 2015). Bên cạnh đó, khá nhiều nghiên cứu cho thấy miRNA đóng vai trò quan trọng trong sự tương tác giữa lúa và nấm M. oryzae (Baldrich và ctv., 2015 ; Li và ctv., 2014). Nghiên cứu cho thấy có nhiều thành phần tác động đến quá trình sinh tổng hợp miRNA, trong đó các protein DCLs, RDRs và AGOs là các thành
31. 14 phần chính tham gia tổng hợp miRNA (Dong và ctv, 2013; Feng và ctv., 2021). Bộ gen của lúa mã hóa tạo ra 8 phân tử OsDCLs và 19 phân tử AGOs (Kapoor và ctv., 2008). Các phân tử OsDCLs bao gồm OsDCL1a, OsDCL1b, OsDCL1c, OsDCL2a, OsDCL2b, OsDCL3a, OsDCL3b/OsDCL5, và OsDCL4 (Kapoor và ctv., 2008; Margis và ctv., 2006). Mỗi phân tử OsDCLs có vai trò tạo ra các phân tử RNAs nhỏ khác nhau. Trong đó, phân tử OsDCL1 và OsDCL3a có vai trò sinh tổng hợp các phân tử miRNAs có kích thước 21-24 nu (Feng và ctv., 2021); phân tử OsDCL3b/OsDCL5 và OsDCL4 tham gia tổng hợp các phân tử siRNAs có kích thước 21-24 nu (Song và ctv., 2012). Các nghiên cứu cho thấy có 5 phân tử OsDCLs đáp ứng với sự xâm nhiễm của nấm M. oryzae là OsDCL1, OsDCL2, OsDCL3a, OsDCL3b/OsDCL5 và OsDCL4 (Du và ctv., 2011; Feng và ctv., 2021; Salvador- Guirao và ctv, 2019). Trong đó, phân tử OsDCL1a có vai trò hỗ trợ cho sự xâm nhiễm của nấm M. oryzae thông qua sự điều hòa giảm các gen mã hóa cho phân tử phytoalexin và các gen kháng OsPR1a và OsPBZ1 (Salvador-Guirao và ctv, 2019). Bên cạnh đó, phân tử OsDCL1 cũng được điều hòa ngược (negative feedback) bởi phân tử miR162a (Zhang và ctv., 2015). Nghiên cứu gần đây cho thấy biểu hiện tăng osa-miR162a sẽ giúp tăng cường khả năng kháng nấm M. oryzae gây bệnh đạo ôn ở lúa thông qua sự kích thích các gen kháng và nồng độ H2O2, nhưng đồng thời biểu hiện tăng osa-miR162a cũng làm giảm sản lượng lúa (Li và ctv., 2020). Để tìm ra các miRNAs liên quan đến sự tương tác giữa lúa và nấm M. oryzae, hầu hết các nghiên cứu đều tiến hành phân tích so sánh sự thay đổi biểu hiện của các miRNAs trên giống lúa kháng và giống lúa mẫn cảm (Baldrich và ctv., 2015; Li và ctv., 2019b). Các nghiên cứu hiện nay đã tìm ra 70 miRNAs từ 61 họ miRNAs có liên quan đến hệ miễn dịch của cây lúa giúp chống chịu với khả năng xâm nhiễm của nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae và các phân tử elicitors của nấm M. oryzae (Phụ lục 1). Hầu hết các miRNAs trong số 70 miRNAs kể trên đều liên quan đến việc điều hòa các gen tham gia vào các hoạt động sinh trưởng, phát triển và miễn dịch ở cây lúa như: điều hòa tín hiệu hormon (auxin, axit salicylic, axit jasmonic, ethylen), tín hiệu gốc tự do (reactive oxygen species - ROS) quá trình sinh tổng hợp sRNA, và các gen
32. 15 ở vùng mã đầu của khung đọc mở (upstream open reading frames) (Li và ctv., 2019b). Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các dạng biểu hiện của một số miRNAs liên quan đến khả năng chống chịu nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae trên lúa (Baldrich và San Segundo, 2016; Campo và ctv., 2021; Li và ctv., 2019b). Các nghiên cứu này chia các miRNAs thành 2 nhóm bao gồm: nhóm miRNAs biểu hiện tăng (up-regulation) như: osa-miR159a, osa-miR160, miR162, osa-miR166, osa-miR398, osa-miR7695, osa-miR812w; và nhóm miRNAs biểu hiện giảm (down-regulation) như: miR164, osa-miR167, osa-miR169, osa-miR319, osa-miR396, osa-miR399, osa-miR439, osa- miR444, miR1873. Một số nghiên cứu khác cũng ghi nhận osa-miR162a, osa-miR396, osa-miR1873 có vai trò cân bằng giữa sản lượng và mức độ kháng M. oryzae trên cây lúa (Chandran và ctv., 2019; Li và ctv., 2020; Zhou và ctv., 2020). 1.3. Vai trò và chức năng của các miRNAs làm tăng khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae Đến thời điểm hiện tại, có 9 miRNAs có biểu hiện tăng liên quan đến việc tăng khả năng kháng nấm M. oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa đã được công bố. Trong đó có 5 phân tử miRNA nổi bật bao gồm các miRNAs sau: osa-miR159a, osa-miR160, osa-miR162, osa-miR166, osa-miR7695. Osa-miR159 được mô tả là có liên quan đến khả năng kháng nấm M. oryzae ở lúa thông qua sự ức chế gen đích là OsGAMYB (Transcriptional activator of gibberellin-dependent alpha-amylase) OsGAMYBL (OsGAMYBL-like), và OsZF (zinc-finger) (Chen và ctv., 2021). Các gen đích này có vai trò trong việc điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa (Millar và ctv., 2019). Osa-miR159 có chiều dài 21 nu, có tính bảo tồn cao ở cây Arabidopsis và cây lúa; osa-miR159 có vai trò ức chế các gen OsGAMYB, OsGAMYBL, và OsZF thông qua quá trình cắt mRNA của các gen này. Trên cây lúa, mô-đun osa-miR159/OsGAMYB kiểm soát các gen liên quan đến sự biểu hiện axit gibberellic, axit abscisic từ đó tác động đến quá trình hấp thu năng lượng và tăng cường chiều cao ở lúa (Zhang và ctv., 2016c). Biểu hiện tăng osa-miR159a làm tăng khả năng kháng nấm M. oryzae ở lúa (Chen và ctv., 2021). Bằng cách dùng kỹ thuật Crisp/Cas9 để triệt tiêu hoạt động của các gen đích
33. 16 OsGAMYB, OsGAMYB và OsZF, kết quả cho thấy tất cả các cây lúa đột biến đều có biểu hiện tăng tính kháng với nấm M. oryzae và mức độ tổn thương giảm so với đối chứng. Ngoài ra, mức độ kháng giảm dần theo thứ tự các dòng lúa đột biến gambl, gamyb và zf. Điều này cho thấy gen OsGAMYBL đóng vai trò quan trọng nhất trong tính kháng bệnh đạo ôn trên lúa so với 2 gen còn lại. Tuy nhiên, kiểu hình của các dòng lúa đột biến gen gambl, gamb và zf đều có sự phát triển bất thường, riêng dòng lúa đột biến zf có kiểu hình ít bị bất thường nhất (Chen và ctv., 2021). Bộ gen của lúa có 6 gen mã hóa cho osa-miR159, và tạo ra các isoforms (miRNA đồng dạng) là: osa- miR159a, osa-miR159b, osa-miR159c, osa-miR159d, osa-miR159e và osa-miR159f. Trong đó, osa-miR159a/b ức chế gen OsGAMYB và OsGAMYBL, và osa-miR159a đóng vai trò quan trọng nhất trong việc tạo tính kháng nấm M. oryzae ở lúa, so với các miRNA đồng dạng còn lại (Chen và ctv., 2021). miR160 là một họ miRNA có tính bảo tồn cao, đóng vai trò trong việc điều hòa các gen ARFs (Auxin response transcription factors genes) ở cây trồng (Li và ctv., 2019b). Trên lúa, biểu hiện tăng osa-miR160 làm tăng khả năng kháng nấm M. oryzae thông qua sự ức chế các gen đích ARFs. Bộ gen của lúa có 6 vị trí gen tạo ra osa-miR160, tuy nhiên chỉ tạo ra 3 isoforms (miRNA đồng dạng) trưởng thành là osa- miR160a/b/c/d, osa-miR160e, và osa-miR160f (Li và ctv., 2019b). Ở lúa, osa-miR160 ức chế 5 gen ARFs (ARF8, ARF10, ARF13, ARF18, ARF22). Trong đó, osa-miR160a ức chế các gen ARF8, ARF10 and ARF13. Biểu hiện tăng osa-miR160a làm tăng khả năng kháng nấm M. oryzae thông qua ức chế các gen đích ARFs (Li và ctv., 2019b). Ở trạng thái bình thường, osa-miR160a tích lũy ở một mức độ nhất định để tăng cường phản ứng miễn dịch bằng cách ngăn chặn sự biểu hiện của ARF. Khi tiếp xúc với mầm bệnh, cây lúa sẽ kích hoạt tích lũy của osa-miR160a dẫn đến tăng cường khả năng chống lại mầm bệnh và giảm biểu hiện ARFs. Trong số các ARFs này, ARF8 hoạt động như một chất điều hòa giảm đối với sự kháng bệnh bằng cách liên kết trực tiếp với promoter và ngăn chặn vi khuẩn phiên mã bởi WRKY45 (transcriptional regulators through W-boxes), mã hóa một cơ quan điều chỉnh chính của khả năng kháng bệnh (Feng và ctv., 2022). Bên cạnh đó, các gen ARFs còn có vai trò trong
34. 17 việc tác động đến tín hiệu auxin điều hòa sinh trưởng ở cây trồng, cho nên cây lúa biểu hiện tăng osa-miR160 sẽ có kiểu hình dị thường như lùn, hạt nhỏ, lá xoăn (Huang và ctv., 2016), đồng thời ức chế tín hiệu auxin là một cách phòng vệ của thực vật trước sự xâm nhiễm của mầm bệnh khi nhiều loại mầm bệnh có khả năng kiểm soát con đường auxin giúp tăng biểu hiện bệnh (Wang và ctv., 2007). miR162 là một họ miRNA có tính bảo tồn ở cây trồng, có liên quan đến căng thẳng sinh học và phi sinh học ở cây trồng (Li và ctv., 2020). Osa-miR162 ức chế gen đích là OsDCL1, gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp hầu hết các miRNAs ở cây trồng. Do vậy, khi biểu hiện osa-miR162 tăng sẽ dẫn đến sự bất thường kiểu hình ở cây trồng (Zhou và ctv., 2010). Liên quan đến đáp ứng căng thẳng phi sinh học ở cây trồng, osa-miR162 làm tăng khả năng thích ứng với khô hạn thông qua sự ức chế gen OsTRE1 (Trehalase precursor 1) ở cây lúa (Tian và ctv., 2015). Ở lúa, biểu hiện tăng osa-miR162 làm tăng khả năng kháng nấm M. oryzae thông qua sự ức chế gen đích OsDCL1, đồng thời osa-miR162 làm tăng mức độ biểu hiện của các gen kháng và tăng nồng độ H2O2 giúp cây lúa chống lại nấm M. oryzae tại vị trí xâm nhiễm (Zhang và ctv., 2015). Osa-miR162 có 2 isoforms là osa-miR162a và osa-miR162b. Nghiên cứu gần đây cho thấy osa-miR162a có vai trò cân bằng khả năng kháng nấm M. oryzae và sản lượng lúa thông qua sự kiểm soát gen đích OsDCL1. Biểu hiện tăng osa-miR162a giúp cây lúa tăng khả năng kháng với nấm M. oryzae, tuy nhiên lại làm giảm sản lượng lúa. Ngược lại, khi biểu hiện giảm osa-miR162a thì cây lúa giảm khả năng kháng nấm M. oryzae nhưng lại tăng sản lượng lúa (Li và ctv., 2020). miR166 là một họ miRNA có tính chất bảo tồn ở cây trồng, đích tấn công là họ gen HD-ZIP III transcription factor, tác động đến sự sinh trưởng và miễn dịch ở cây trồng (Li và ctv., 2019b; Salvador-Guirao và ctv., 2018). Các nghiên cứu cho thấy miR166 liên quan đến các căng thẳng sinh học và phi sinh học ở cây trồng, phổ tác động của miR166 rất rộng và tùy thuộc từng giống cây trồng (Khraiwesh và ctv., 2012). Họ miR166 có khoảng 262 isoforms khác nhau ở 45 giống cây trồng, riêng ở lúa có 13 gen MIR166 tạo ra 6 isoforms (Li và ctv., 2019b). Sự biểu hiện tăng miRNA đa nang (polycistronic miRNA) osa-miR166k-miR166h làm tăng khả năng kháng
35. 18 nấm M. oryzae trên lúa thông qua sự điều khiển gen EIN2 (ethyleneinsensitive 2) (Salvador-Guirao và ctv., 2018). Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của các thành viên trong họ osa-miR166 có sự khác nhau trong quá trình nhiễm nấm M. oryzae hoặc tiếp xúc với các phân tử elicitors của nấm M. oryzae (Li và ctv., 2019b). Ví dụ osa- miR166m giảm biểu hiện khi được xử lý với các phân tử elicitors của nấm M. oryzae, trong khi osa-miR166k, osa-miR166j lại tăng biểu hiện khi tiếp xúc với nấm M. oryzae (Campo và ctv., 2013). Điều này cho thấy các thành viên trong họ osa-miR166 có vai trò khác nhau trong việc điều hòa cây lúa kháng lại nấm M. oryzae (Li và ctv., 2019b). Bên cạnh đó, biểu hiện tăng miRNA đa nang osa-miR166k-miR166h còn giúp lúa tăng khả năng kháng với nấm Fusarium fujikuroi gây bệnh lúa von (Bakanae disease) (Li và ctv., 2019b). Osa-miR7695 đóng vai trò điều hòa tăng khả năng kháng nấm M. oryzae và được biểu hiện ở lá trong suốt giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng của lúa (Campo và ctv., 2013). Osa-miR7695 biểu hiện cao ở nhóm lúa chống chịu và tăng mức độ biểu hiện khi bị nhiễm nấm M. oryzae (Campo và ctv., 2013; Quoc và ctv., 2019). Hiện tại, osa-miR7695 chỉ được tìm thấy ở cây lúa, bao gồm cả ở giống lúa japonica và indica (Campo và ctv., 2013; Quoc và ctv., 2019). Osa-miR7695 tấn công gen đích là OsNramp6 (Natural resistance-associated macrophage protein 6). Gen OsNramp6 đóng vai trò trong việc điều hòa nồng độ ion kim loại sắt và mangan ở lúa. Biểu hiện tăng phân tử OsNramp6 làm giảm khả năng kháng với nấm M. oryzae thông qua cơ chế làm giảm nồng độ ion sắt ở lúa (Peris-Peris và ctv., 2017). Tổng cộng có 8 biến thể phiên mã của gen OsNramp6 sau quá trình cắt nối (alternative splicing). Trong đó, biến thể OsNramp6.1 và OsNramp6.8 có liên quan đến khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa (Campo và ctv., 2013; Peris-Peris và ctv., 2017). 1.4. Vai trò và chức năng của các miRNAs làm giảm khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae. Cho đến nay, có 9 miRNAs có biểu hiện tăng liên quan đến làm giảm khả năng kháng nấm M. oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa đã được mô tả chức năng, trong đó có
36. 19 5 phân tử nổi bật bao gồm: osa-miR164, osa-miR167, osa-miR169, osa-miR319, osa- miR396. miR164 là một họ miRNA có tính bảo tồn cao ở cây trồng, gen đích là họ gen NAC transcription factor. Họ gen NAC transcripition factor là một trong những họ gen TF (Transcription factor) lớn nhất ở cây trồng, tham gia vào các quá trình điều hòa sự sinh trưởng, phát triển, đáp ứng với căng thẳng sinh học và phi sinh học ở cây trồng (Fang và ctv., 2014; Yuan và ctv., 2019). Gen NAC được chia thành 3 nhóm nhỏ (NAM, CUC và ATAF) tùy thuộc vào cấu trúc vùng C-terminal của protein NAC (Yuan và ctv., 2019). Ở lúa, có khoảng 151 gen NAC, mỗi gen NAC ở lúa lại có vai trò khác nhau (Yuan và ctv., 2019). Ví dụ như biểu hiện tăng OsNAC10, OsNAC14 làm tăng khả năng chống chịu hạn ở lúa (Jeong và ctv., 2010; Shim và ctv., 2018); biểu hiện tăng OsNAC4 làm tăng quá trình chết ở tế bào lúa (Kaneda và ctv., 2009); biểu hiện tăng OsNAC111 làm tăng mức độ biểu hiện của các gen kháng chống lại nấm M. oryzae ở lúa (Yokotani và ctv., 2014); biểu hiện tăng OsNAC66 làm tăng mức độ kháng nấm M. oryzae ở lúa (Yuan và ctv., 2019). Nghiên cứu gần đây cho thấy biểu hiện giảm OsNAC60 làm tăng sự mẫn cảm với nấm M. oryzae, hay nói cách khác là biểu hiện tăng OsNAC60 sẽ làm tăng khả năng kháng với nấm M. oryzae (Wang và ctv., 2018). Ở lúa, họ osa-miR164 bao gồm 6 isoforms (osa-miR164a/b/f, osa-miR164c, osa-miR164d, osa-miR164e) trong đó osa-miR164a có vai trò ức chế trực tiếp đối với OsNAC60. Biểu hiện tăng osa-miR164a làm giảm khả năng kháng với nấm M. oryzae (Wang và ctv., 2018). Nghiên cứu cũng cho thấy OsNAC60 có vai trò làm tăng đáp ứng miễn dịch ở cây trồng thông qua các hoạt động như tăng mức độ tích lũy ROS, tăng mức đào thải ion (ion leakage) tăng tích lũy callose và tăng mức độ biểu hiện của các gen kháng (Wang và ctv., 2018). Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy osa-miR64 được kiểm soát bởi mô-đun osa-miR168/AGO trong việc tạo tính miễn dịch với nấm M. oryzae (Wang và ctv., 2021a). miR167 là một họ miRNA có tính bảo tồn ở cây trồng, gen đích tấn công là họ gen Auxin responsive factor (ARF) và gen Nucleotide leucine repeat (NLR) (Zhao và ctv., 2019). Auxin là một hormon chính ở cây trồng có vai trò điều hòa cây trồng sinh
37. 20 trưởng và phát triển, từ giai đoạn phôi đến khi cây chết. Các nghiên cứu cho thấy auxin điều hòa tất cả các quá trình trên bằng cách điều khiển sự biểu hiện gen thông qua các nhân tố phiên mã ARFs (Li và ctv., 2016a). Nhân tố ARF gắn vào vùng promoter của các gen được điều hòa bởi auxin (auxin-related gene –ARG) để kích hoạt hoặc ức chế dựa vào vùng domain đặc trưng (AuxRE) của protein được mã hóa bởi gen ARG (Li và ctv., 2016a). Các gen ARFs có vai trò khác nhau, hoạt động ở giai đoạn phiên mã và sau dịch mã đối với gen được điều khiển (Li và ctv., 2016b). Mức độ biểu hiện của các gen ARFs được kiểm soát bởi các microRNAs (Baldrich và ctv., 2015; Li và ctv., 2016b). Hoạt động của các gen ARFs ở lúa và Arabidopsis tương đồng với nhau, trong đó ARF6, ARF8, ARF12 là gen đích của osa-miR167; ARF10, ARF6 và ARF17 là gen đích của osa-miR160 (Li và ctv., 2016a; Zhao và ctv., 2019). Ở lúa, osa-miR167 có 10 thành viên (từ osa-miR167a đến osa-miR167j) trong đó osa-miR167d ức chế trực tiếp gen đích ARF12. Biểu hiện tăng của osa-miR167d làm giảm khả năng kháng nấm M. oryzae thông qua sự ức chế gen ARF12 ở thời điểm 24h sau khi nhiễm nấm M. oryzae (Zhao và ctv., 2019). Nghiên cứu cho thấy biểu hiện tăng ARF12 làm tăng mức độ biểu hiện gen OsGH3-2 (auxin-responsive GH3 gene) là gen có vai trò bất hoạt IAA (một dạng hormon auxin). Biểu hiện tăng hormon IAA làm tăng mức độ mẫn cảm với nấm M. oryzae thông qua việc tạo ra protein expansin, protein làm giảm độ cứng cáp của thành tế bào cây lúa (Fu và ctv., 2011). Tóm lại, khi tăng mức độ biểu hiện ARF12 sẽ làm tăng mức độ kháng với nấm M. oryzae ở lúa (Fu và ctv., 2011; Zhao và ctv., 2019) miR169 là một họ miRNA có 17 thành viên, tấn công vào gen đích là NF-YA (nuclear transcription factor Y subunit) (Li và ctv., 2019b). Họ gen NF-Ys là một họ gồm nhiều thành viên, sản phẩm là các protein tiểu đơn vị gắn đặc hiệu vào CCAAT- box ở vùng promoter (upstream) và điều hòa các gen vùng hạ nguồn (downstream) (Zhao và ctv., 2017). Bên cạnh protein tiểu đơn vị NF-YA, còn có NF-YB và NF-YC, các tiểu đơn vị này hợp thành protein thể ba (heterotrimer protein) có hoạt tính (Mantovani, 1999). Ở cây trồng, các tiểu đơn vị NF-Ys được mã hóa bởi một nhóm gen có số lượng khác nhau ở mỗi loại cây trồng. Ví dụ như ở lúa, có 11 gen NF-YA,
38. 21 11 gen NF-YB và 7 gen NF-YC; còn ở Arabidopsis thì có 10 gen NF-YA, 10 gen NF- YB và 10 gen NF-YC (Petroni và ctv., 2012). Ở lúa, 8 trong số 11 gen NF-YA được báo cáo là gen đích của osa-miR169, bao gồm NF-YA1 đến NF-YA6, NF-YA10 và NF-YA11 (Li và ctv., 2017). Sự gia tăng biểu hiện của OsNF-YA giúp tăng khả năng kháng nấm, vi khuẩn (Li và ctv., 2017). Nghiên cứu cho thấy, Mô-đun miR169/NF- YA có vai trò khác nhau trong việc điều hòa chống lại các căng thẳng phi sinh học (abiotic stress) ở thực vật (Li và ctv., 2017). Các nghiên cứu cho thấy biểu hiện tăng osa-miR169 làm giảm khả năng kháng nấm M. oryzae ở cây lúa (Dong và ctv., 2018; Li và ctv., 2017). Trên lúa, osa-miR169 được biết đến như một phân tử điều hòa giảm khả năng miễn dịch của cây lúa đối với nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae. Tuy nhiên, cơ chế hoạt động của osa-miR169 thì vẫn chưa được khám phá rõ ràng (Li và ctv., 2017). Thí nghiệm trên giống lúa chuyển gen có biểu hiện tăng cao osa-miR169a cho thấy cây lúa trở nên cực kỳ mẫn cảm với nhiều chủng nấm M. oryzae, đồng thời cây lúa giảm biểu hiện các gen kháng và giảm tích lũy H2O2. Ngược lại, khi cho cây lúa biểu hiện gen đích giả để bắt giữ các phân tử osa-miR169a thì cây lúa được tăng cường khả năng kháng nấm M. oryzae (Li và ctv., 2017). Tóm lại, osa-miR169 điều hòa giảm khả năng kháng nấm M. oryzae thông qua sự ức chế gen đích NF-YA. miR319 là một họ miRNA có tính bảo tồn cao ở cây trồng, gen đích tấn công là OsTCP21 (Teosinte branched/cycloidea/proliferation cell factor 21) gen OsTCP21 có vai trò mã hóa cho nhân tố phiên mã điều hòa các hoạt động sinh trưởng, phát triển và miễn dịch của cây trồng (Fang và ctv., 2021; Lopez và ctv., 2015). Mô-đun osa- miR319/TCP21 đã được báo cáo có liên quan đến việc tăng cường khả năng chống chịu với các căng thẳng phi sinh học ở lúa như: tăng khả năng chống chịu lạnh (Wang và ctv., 2014), tăng cường sản lượng lúa (Wang và ctv., 2021b). Trong điều kiện bình thường, TCP có vai trò tăng cường hệ thống miễn dịch ETI thông qua TIR (Toll/interleukin-1 receptor) và NLR (nucleotide-binding domain leucine-rich repeat protein). Tuy nhiên, một số sinh vật gây bệnh có thể lợi dụng TCP để điều khiển hệ thống miễn dịch ở cây trồng và kích hoạt hệ thống hỗ trợ effector của mầm bệnh ETS (effector-triggered susceptibility). Các nghiên cứu cho thấy, ở trên lúa sinh vật gây
39. 22 bệnh có thể sử dụng mô-đun osa-miR319/OsTCP21 để mở đường cho sự xâm nhiễm của virus gây bệnh vàng lùn xoắn lá lúa (Rice ragged stunt virus-RRSV) thông qua sự ức chế con đường Jasmonic acid. Biểu hiện tăng osa-miR319 làm tăng mức độ mẫn cảm với RRSV (Zhang và ctv., 2016a). Hoặc nấm M. oryzae cũng sử dụng mô-đun osa-miR319/OsTCP21 ức chế con đường axit Jasmonic để từ đó mở đường cho sự xâm nhiễm của nấm M. oryzae trên lúa. Biểu hiện tăng osa-miR319/OsTCP21 làm tăng mức độ mẫn cảm của lúa với nấm M. oryzae (Zhang và ctv., 2018) miR396 là một họ miRNA có tính bảo tồn cao, gồm có 8 biến thể, gen đích tấn công là gen Growth regulating factor (GFR) (Gao và ctv., 2015). osa-miR396 điều hòa giảm khả năng kháng nấm M. oryzae thông qua sự kìm hãm các gen OsGRFs (Chandran và ctv., 2019). Tổ hợp osa-miR396/OsGRFs điều chỉnh sự cân bằng giữa năng suất lúa và khả năng kháng nấm M. oryzae (Chandran và ctv., 2019; Duan và ctv., 2015). Ở lúa, có tất cả 12 gen OsGRFs chia làm 3 nhóm có đặc tính tương đồng nhau là: nhóm 1 (OsGRF1, OsGRF2, OsGRF3, OsGRF4, OsGRF5) nhóm 2 (OsGRF6, OsGRF7, OsGRF8, OsGRF9) và nhóm 3 (OsGRF10, OsGRF11, OsGRF12). Trong 3 nhóm gen OsGRFs, chỉ có duy nhất nhóm 2 có biểu hiện tăng mạnh khi có sự xâm nhiễm của nấm M. oryzae, và nhóm 2 có vai trò tăng cường khả năng kháng nấm M. oryzae trên lúa (Chandran và ctv., 2019). Các nghiên cứu cho thấy, osa-miR7695 có vai trò điều hòa tăng khả năng kháng nấm M. oryzae ở lúa thông qua sự ức chế gen OsNramp6 (Campo và ctv., 2013). Sau đây, tác giả xin trình bày về vai trò và chức năng của gen OsNramp6 tham gia trong quá trình điều hòa cây lúa chống chịu lại nấm gây bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae. 1.5. Vai trò và chức năng của gen OsNramp6 Ở cây trồng, các ion kim loại được vận chuyển bởi các protein vận chuyển nằm trên màng tế bào, bao gồm các họ protein vận chuyển như P1B-ATPase, NRAMP, CDF, và ZIP (Maestri và ctv., 2010). Các protein vận chuyển nằm trên màng plasma đóng vai trò vận chuyển và điều hòa lượng ion kim loại ở cây trồng (Komal và ctv.,
40. 23 2015). Trong số các họ protein vận chuyển kể trên thì họ protein NRAMP được phát hiện có vai trò trong việc điều hòa cây lúa kháng lại nấm M. oryzae (Campo và ctv., 2013). Các protein NRAMP được phát hiện đầu tiên ở đại thực bào của chuột (Vidal và ctv.,1993), sau đó chúng được phát hiện ở vi khuẩn, nấm men, tảo, nấm mốc, cây trồng, và động vật (Nevo và Nelson, 2006). Các thành viên trong họ protein NRAMP có vai trò trong việc vận chuyển các ion Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+, Ni2+, Co2+, và Al3+ (Sasaki và ctv., 2012). Chức năng vận chuyển ion kim loại của protein NRAMP được bảo tồn ở tất cả các giới (Peris-Peris và ctv., 2017). Các nghiên cứu về chức năng của gen Nramp hầu hết được tiến hành trên cây lúa (Oryza sativa) và cây Arabidopsis. Có tổng cộng 6 gen Nramp ở Arabidopsis và 8 gen Nramp ở lúa (Belouchi và ctv., 1997; Thomine và ctv., 2000). Trong đó, AtNramp1 và (OsNramp1, OsNramp3) có sự tương đồng, đóng vai trò trong việc điều hòa nồng độ sắt ở cây Arabidopsis và lúa (Curie và ctv., 2000). AtNramp3 và AtNramp4 đóng vai trò trong việc điều khiển sự cân bằng nồng độ Mn2+ (Lanquar và ctv., 2010), ngoài ra khi tăng biểu hiện AtNramp3 dẫn đến sự nhạy cảm với Cd2+ ở rễ và tăng cường sự tích lũy sắt (Thomine và ctv., 2003). AtNRAMP5 đóng vai trò trong việc vận chuyển Fe2+ và Mn2+ tham gia vào khả năng hữu thụ ở Arabidopsis thaliana (Pottier và ctv., 2013). AtNramp6 đóng vai trò trong vận chuyển Cd2+ và khi AtNramp6 biểu hiện tăng sẽ dẫn đến tăng cường mức độ mẫn cảm với Cd2+ ở Arabidopsis thaliana (Cailliatte và ctv., 2009). Ở lúa, có tất cả 8 gen Nramps mã hóa tạo ra 8 protein NRAMPs, được đánh số thứ tự từ OsNRAMP1 đến OsNRAMP8 (Gross và ctv., 2003), các protein OsNRAMPs này cũng đóng vai trò trong việc vận chuyển, cân bằng các ion kim loại ở cây lúa Oryza sativa. Trong đó, OsNRAMP1 đóng vai trò trong việc vận chuyển Fe2+, Cd2+ và Asen nhưng không vận chuyển Mn2+ (Tiwari và ctv., 2014). Gen OsNramp1 chủ yếu được biểu hiện ở rễ, còn OsNramp2 được biểu hiện ở lá, OsNramp3 được biểu hiện ở cả lá và rễ (Belouchi và ctv., 1997). Nghiên cứu gần đây cho thấy protein OsNRAMP2 được kích thích chủ yếu ở trong chồi khi nồng độ Cadmium tích lũy cao
41. 24 (Zhao và ctv., 2018). Khác với protein OsNRAMP1 không có chức năng vận chuyển Mn2+, protein OsNRAMP3 có thể vận chuyển được Mn2+ và phân phối trong các bó mạch, đặc biệt là tế bào mạch rây (Yang và ctv., 2013). Hầu hết các protein OsNRAMP vận chuyển ion hóa trị 2, chỉ riêng protein OsNRAMP4 là có chức năng vận chuyển được Al3+, ion 3 hóa trị (Peris-Peris và ctv., 2017). Protein OsNRAMP5 có chức năng vận chuyển Fe2+, Mn2+ và Cd2+ (Ishimaru và ctv., 2012). Protein OsNRAMP6 có vai trò tương tự protein OsNRAMP5 là vận chuyển Fe2+ và Mn2+. Các nghiên cứu gần đây cho thấy gen OsNramp6 còn đóng vai trò trong việc điều hòa cây lúa (Oryza sativa) chống lại nấm M. oryzae (Campo và ctv., 2013; Peris-Peris và ctv., 2017). Sau quá trình cắt nối thay thế (alternative splicing) gen OsNramp6 tạo ra 8 biến thể phiên mã khác nhau (08 transcript variants) được đánh số thứ tự từ 1 đến 8 (OsNramp6.1 đến OsNramp6.8). Trong đó, đoạn dài nhất được ký hiệu là l-Nramp6 (Os01g31870.1) chứa đầy đủ trình tự của gen Nramp6 và đoạn ngắn nhất được ký hiệu là s-Nramp6 (Os01g31870.8) do thiếu đoạn intron 6 (Peris-Peris và ctv., 2017). Ở lúa, gen OsNramp6 đóng vai trò trong việc cân bằng nồng độ Fe2+. Khi gen OsNramp6 biểu hiện tăng thì dẫn đến khả năng kháng nấm M. oryzae giảm (Campo và ctv., 2013). Giữa gen OsNramp6 và osa-miR7695 có sự tương tác với nhau, cụ thể là osa-miR7695 ức chế sự biểu hiện của gen OsNramp6 dẫn đến khi osa-miR7695 biểu hiện tăng thì cây lúa cũng tăng cường khả năng kháng lại nấm M. oryzae thông qua sự ức chế gen OsNramp6 (Campo và ctv., 2013). Trong nghiên cứu của Campo và ctv., 2013) cho rằng chỉ có duy nhất biến thể có chiều dài ngắn nhất s-Nramp6 (OsNramp6.8) chứa trình tự bổ sung với tiền phân tử osa-miR7695 (osa-miR7695 precursor) đồng thời mức độ tích lũy của s-Nramp6 cũng giảm khi osa-miR7695 tăng biểu hiện.
42. 25 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu Đánh giá khả năng chống chịu hoặc mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn (Magnaporthe oryzae) trên 19 giống lúa trồng ở Việt Nam. Xác định sự hiện diện và phân tích mức độ biểu hiện của một số phân tử microRNA (osa-miR7695, osa-miR169a, osa-miR160a) trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae. Đánh giá mức độ biểu hiện của các biến thể phiên mã (transcripts) OsNramp6 trên các nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm với nấm M. oryzae. Tìm hiểu mối liên hệ giữa các biến thể phiên mã OsNramp6 và một số microRNAs liên quan đến khả năng kháng với nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae. 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10 năm 2015 đến tháng 10 năm 2020 tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Các giống lúa thí nghiệm được thu thập ở các Viện, công ty, vùng trồng lúa ở các tỉnh thuộc Việt Nam. Các giống lúa thí nghiệm được trồng tại nhà lưới Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Nghiên cứu mức độ biểu hiện của các phân tử microRNAs và các biến thể OsNramp6 được thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. 2.3. Vật liệu nghiên cứu 19 giống lúa thu thập được ở các vùng trồng lúa thuộc các tỉnh miền Bắc, miền Trung, miền Nam Việt Nam (Bảng 2.1) Nguồn mẫu nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae LBT2 được lấy từ bộ sưu tập mẫu nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae tự phân lập (Hòa và ctv., 2016) được thu thập ở
43. 26 các vùng trồng lúa thuộc các tỉnh thành miền Bắc, miền Trung và miền Nam Việt Nam. Môi Trường nuôi cấy nấm M. oryzae: + Môi trường CM (môi trường tăng sinh nấm M. oryzae) 1,5g casamino acid 0,3%; 1,5g cao nấm men 0,3%; 2,5g đường sucrose 0,5%; pha trong 500ml nước cất. + Môi trường OMA (oat meal agar) (môi trường phát triển bào tử nấm M. oryzae) Bột yến mạch 25g; đường sucrose 15g; Agar 20g; nước cất đến 1000ml. + Môi trường tổng hợp PDA (Potato dextrose agar) (Môi trường cho sự phát triển của nấm M. oryzae) (Himedia-Ấn Độ) bột lỏng khoai tây 200 g/l, Dextrose 20 g/l, Agar 15 g/l, pH 5.6. DNA lý trích từ các mẫu nấm M. oryzae và được sử dụng để định danh nấm M. oryzae bằng kỹ thuật PCR với primer Pot2 transposon (Pot2-F: 5’ CGTCACACGTTCTTCAACC 3’ và Pot2-R: 5’ CGTTTCACGCTTCTCCG 3’) (Harmon và ctv, 2003). RNA tổng được lý trích theo phương pháp Trizol từ cây lúa 14 ngày tuổi ở các thời điểm 24h, 48h, 72h sau khi cho nhiễm nấm M. oryzae. Hóa chất sử dụng cho kỹ thuật qRT-PCR: SensiFAST SYBR No-ROX mix (Bioline, UK), DNase I-RNase free (ThermoFisher, USA), các đoạn primer phiên mã ngược, các đoạn primer cho phân tích biểu hiện osa-miR7695, OsNramp6, osa- miR169a, osa-miR160a, EDTA 0.5M, TransAmp Buffer, Reverse Transcriptase. Hóa chất để điện di sản phẩm PCR: agarose (Promega, Mỹ), TBE bufer 1X (Promega, Mỹ), ladder 100 bp, 1kb (Promega, Mỹ). Hóa chất để thực hiện tổng hợp cDNA: RNA tổng số, ProtoScript II reaction Mix 10X và 20X. Hóa chất để thực hiện qPCR: Mastermix (Gotag), đoạn primer, cDNA, nước tinh khiết không RNAase. Các thiết bị: Kính hiển vi, nồi hấp khử trùng (Tommy – Nhật Bản), cân điện tử (Ohaus – Trung Quốc), bếp điện, tủ cấy (Thiên Trường Scientific – Việt Nam), tủ
44. 27 mát, tủ lạnh -20 ºC, tủ sấy ( Boxun – Trung Quốc), máy vortex (EMCLAB – Đức), máy lắc (Stuart Scientific – Anh), máy PCR (Eppendoft – Đức), máy ly tâm (Beckman Coulter – Mỹ), bồn điện di (Advance – Nhật Bản), máy chụp gel (MultiDoc – It – Mỹ), lò vi sóng (Electrolux – Nhật Bản), khay đổ gel (OPTIMA, Nhật), đèn Blacklight. Dụng cụ và vật tư tiêu hao khác: đèn cồn, que cấy tam giác, que cấy móc, kim mũi mác, lame, lammele, đĩa Petri, bình tam giác, becher, bình cầu, nước cất 2 lần, cốc thủy tinh, giấy thấm nước, micropipette và đầu tube các loại. Bảng 2.1. Danh sách giống lúa sử dụng trong thí nghiệm. STT Giống lúa Đặc điểm Vị trí thu nhận (Huyện, Tỉnh) 1 ST5 Gạo thơm Trần Đề, Sóc Trăng 2 Caroline gold Gạo hạt dài Hoa Kỳ 3 RVT Fragrant rice Cần Đước, Long An 4 OM8017 Giống lúa thuần (OM5472 / Long Mỹ, Hậu Jasmin85) Giang 5 OM5451 Giống lúa thuần (Jasmine 85 / OM Vũng Liêm, Vĩnh 2490) Long 6 IR50404 Gạo chuẩn IRRI 7 OM2517 Gạo lai (OM1325 / OMCS94) Phụng Hiệp, Hậu Giang 8 OM6162 Giống lúa thuần (C50 / Thạnh Phú, Kiên Jasmine85) Giang 9 OM9582 Giống lúa thuần (OM6976 / Tam Nông, Đồng OM5166) Tháp 10 OM9921 Giống lúa thuần (OM2517 / Rồng Khánh Bình, Cà
45. 28 xanh // Lúa dài 72) Mau 11 Nang Hoa 9 Giống lúa cao sản Tân An, Long An 12 Jasmine85 Giống lúa thơm cao sản IRRI 13 OM4900 Giống lúa thuần (C53 / Tri Tôn, An Giang Jasmine85) 14 OM576 Giống lúa thuần (Hunggary / Long Xuyên, An IR48) Giang 15 OM7347 Giống lúa thuần (KDM / BL) Vĩnh Lợi, Bạc Liêu 16 BC15 Giống lúa cao sản Công ty giống Thái Bình. 17 OM344 Giống lúa chất lượng cao Long Mỹ, Hậu (CK2003 / OM2008) Giang 18 OM4218 Giống lúa thuần (OM 2031 / Châu Phú, An MTL250) Giang 19 OM6976 Giống lúa thuần (IR68144 / Châu Phú, An OM997 // OM2718 /// OM2868) Giang 20 MH480 Giống lúa lai Đồng bằng sông Cửu Long 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp xác định và đánh giá khả năng chống chịu với nấm M. oryzae trên các giống lúa thí nghiệm. Các giống lúa (Bảng 2.1) được thu thập là các giống lúa lai được trồng ở các vùng trồng lúa đang canh tác thuộc các tỉnh thành ở miền nam Việt Nam. Các giống được chọn theo tiêu chí sát với thực tế, là các giống lúa đang được canh tác và không chọn các giống lúa thuần. Các giống lúa được tác động bởi tác nhân gây stress (nấm gây bệnh đạo ôn) để từ đó đánh giá mức độ biểu hiện của microRNA (osa-miR7695, osa-miR169a, osa-miR160a) và các biến thể OsNramp6 ở các thời điểm sau lây nhiễm
46. 29 khác nhau. Việc phân biệt mức độ kháng nấm M. oryzae bằng cách đo mức độ nhiễm bằng phần mềm Access 2.0 (Lamari, 2008). Phần mềm Access 2.0 đã được ứng dụng trong việc phân biệt và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn (Campos-Soriano và ctv., 2020). Trong đó, các giống lúa chống chịu mạnh có mức độ nhiễm dưới 25% (Phansak và ctv., 2021). Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại tương ứng 3 chậu cho mỗi nghiệm thức đánh giá. Hạt giống của mỗi nghiệm thức được khử trùng trước khi nảy mầm bằng cách lắc qua dung dịch Ethanol 70% trong 5 phút, rửa lại với nước cất 3 lần, tiếp đến khử trùng bằng Javel 1% trong 60 giây và tiếp tục rửa sạch bằng nước cất tiệt trùng. Sau đó, các hạt giống lúa được ngâm trong đĩa petri trong 36 giờ và ủ ẩm trong 48 giờ để các hạt giống nảy mầm và được gieo vào các chậu nhựa kích thước 18-14 cm (tương ứng chiều cao-ngang) với mỗi chậu 5 hạt. Các giống lúa được trồng thành cây con 14 ngày tuổi trong nhà lưới của phòng thí nghiệm RIBE302- 304, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh trước khi chủng bệnh theo quy trình của Campo và ctv. (2013). Trong nghiên cứu này, các mẫu nấm gây bệnh đạo ôn được phân lập từ các mẫu lá lúa nhiễm bệnh đạo ôn tại Đồng Nai, Tiền Giang, sau đó được định danh loài và kiểm tra tính chuyên biệt bằng primer Pot2 transposon theo phương pháp đã được mô tả trước đây (Harmon và ctv., 2003). Những mẫu nấm gây bệnh đạo ôn được kích bào tử trong môi trường oat meal agar ở nhiệt độ 25 0C trong thời gian 6 ngày. Các sợi nấm sẽ được loại bỏ bằng cách chà xát trên bề mặt môi trường nuôi cấy bằng thanh bông gòn tiệt trùng và giữ mẫu ở nhiệt độ 25 0C trong hai ngày dưới đèn UV chuyên biệt. Bào tử sẽ đươc thu hồi bằng cách thêm nước cất vào môi trường nuôi cấy, chà xát trên bề mặt bằng thanh bông gòn tiệt trùng, lọc bằng giấy kimwipe và đếm trên buồng đếm tế bào hồng cầu dưới kính hiển vi. Mẫu nấm sẽ được nuôi cấy trong 100 ml môi trường CM lỏng (0,3% casamino acids, 0,3% yeast extract, 0,5% sucrose) ở 26 0C cho việc chiết xuất DNA tổng số theo hướng dẫn của kit GeneJET
47. 30 Plant Genomic DNA purification và thực hiện phản ứng PCR để định danh bằng primer Pot2 transposon (Phụ lục 2.1). Để chuẩn bị cho dung dịch huyền phù bào tử nấm gây bệnh đạo ôn, mẫu nấm phân lập M. oryzae LBT2 được lấy từ bộ sưu tập giống nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae (Hòa và ctv., 2016) nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường oatmeal agar (25 g oatmeal, 15 g sucrose, 20 g agar, 1000 ml nước cất) trong 2 tuần. Tiếp đó, chuyển đĩa petri vào tối, chiếu đèn Blacklight tạo UV trong thời gian 2-3 ngày ở 25 oC để kích thích bào tử nảy mầm. Sau đó, bào tử M. oryzae LBT2 được phân lập, quan sát dưới kính hiển vi quang học và đếm số lượng bằng buồng đếm tế bào hồng cầu (Hemocytometer). Tiếp theo, bào tử nấm M. oryzae LBT2 được pha loãng ở nồng độ 1x105 -5x105 bào tử/ml và trộn với dung dịch Tween20 0.1%, sau đó phun sương dung dịch bào tử này lên lá lúa 14 ngày tuổi của 19 giống lúa (Bảng 2.1). Lá lúa sau khi phun bào tử nấm M. oryzae sẽ được đưa vào trong tối, ẩm ở nhiệt độ 25 oC để qua đêm và sau đó đưa ra nhà lưới. Theo dõi và ghi nhận kết quả mỗi nghiệm thức 5 cây cho một lần lặp lại và theo dõi lá thứ hai từ lá thành thục trên cùng. Vùng lá bị nhiễm của 19 giống lúa được thu thập ở các thời điểm 24h, 48h, và 72h sau khi nhiễm (hour post innoculation - hpi). Các mẫu lá được trữ lạnh và ly trích để thu thập RNA tổng. Sau 5-7 ngày, các mẫu lá lúa nhiễm nấm M. oryzae được thu thập 3 lá cho một cây lúa (lặp lại 5 cây cho mỗi nghiệm thức) và đánh giá mức độ nhiễm bằng phần mềm Assess 2.0 (APS Press, USA) (Lamari, 2008) để so sánh mức độ nhiễm theo công thức: [Mức độ nhiễm (%) = (diện tích nhiễm/ diện tích lá)*100]. 2.4.2. Phương pháp chiết xuất RNA. RNA tổng (bao gồm miRNA) của mẫu lá nhiễm bệnh ở các thời điểm khác nhau được chiết xuất bằng Trizol, trong môi trường vô trùng và không có RNAase, theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Thermo Fisher Scientific, USA). Quy trình tiến hành như sau: 1 g mẫu lá được nghiền với nitơ lỏng sau đó thêm 1 ml Trizol và giữ 10 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp đó, cho thêm 200 μL chloroform (giữ lạnh) vào và ly
48. 31 tâm ở tốc độ 10.000 rpm trong 10 phút. Dịch nổi được chuyển vào ống eppendorf 1.5ml, sau đó thêm 600 μl isopropanol và cho kết tủa ở nhiệt độ −20 °C để qua đêm. Ngày tiếp theo, lấy hỗn dịch đem đi ly tâm 20 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút và lấy phần kết tủa đem đi rửa với diethyl pyrocarbonate (DEPC) ethanol 2 lần và để khô trong chân không. Cuối cùng, phần kết tủa được hòa tan với 100 μL nước không có nuclease. Đo nồng độ và mức độ tinh khiết của RNA bằng máy NanoDrop™ 1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). Tất cả các mẫu RNA được xử lý với DNase I, Amplification Grade (Invitrogen, USA) để loại bỏ các phân tử DNA tồn dư. Quy trình xử lý với DNase I như sau: 1 μg RNA tổng được hòa tan với buffer DNase I 1X để cho ra dung tích là 50 μL, tiếp đó thêm DNase (200 U/ml) và ủ ở 37 oC trong 10 phút. Cuối cùng, để bất hoạt phản ứng, EDTA 0.5 M được thêm vào và ủ ở 75 °C trong 10 phút (Phụ lục 2). 2.4.3. Phương pháp xác định sự hiện diện của phân tử osa-miR7695 trên các giống lúa thí nghiệm. Kỹ thuật nested RT-PCR được sử dụng để xác định sự hiện diện của osa- miR7695 ở 19 giống lúa với các đoạn primer đặc hiệu (Campo và ctv., 2013) (Hình 2.1) (Bảng 2.2). Quy trình được tiến hành như sau: RNA tổng (Total RNA) được phiên mã ngược thành cDNA bằng kít SensiFAST cDNA Synthesis (Bioline, UK) (Quoc và ctv., 2019) (Phụ lục 3). Sản phẩm sau khi chạy RT-PCR của osa-miR7695 được nhân dòng (clone) vào trong vector pJET1.2 và chuyển vào tế bào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt (Thermo Fisher Scientific, USA). Phương pháp này được tiến hành như sau: một khuẩn lạc đơn E.coli DH5α duy nhất thu hồi từ đĩa thạch được nuôi cấy trong 1 ml môi trường LB và ủ trong tủ ủ lắc có tốc độ 200 rpm ở nhiệt độ 37 oC trong 12-16 giờ. Tiếp đến bổ sung 99 ml môi trường LB và tiếp tục ủ lắc trong 3 - 4 giờ cho đến khi đo mật độ quang của mẫu ở bước sóng 600 nm đạt 0.4. Dịch nuôi cấy tế bào được đặt trên đá trong 20 phút sau đó li tâm lạnh ở 4 oC, 4000 rpm trong 10 phút và loại bỏ phần môi trường nuôi cấy. Sinh khối tế bào sau li tâm được tái huyền phù trong 20 ml CaCl2 0,1M lạnh trong 30 phút sau đó tiếp tục li tâm lạnh ở 4 0C, 4000 rpm trong 10 phút, loại bỏ phần dịch nổi và tái huyền phù trong 5 ml
49. 32 o hỗn hợp CaCl2 0,1M + 15% glycerol, trữ trong tủ âm sâu -80 C chuẩn bị cho phản ứng sốc nhiệt. Ở giai đoạn sốc nhiệt, các tế bào được làm tan băng, bổ sung 1-5 μl (10 pg – 100 ng) plasmid và ủ trên đá trong 30 phút. Sau đó chuyển hỗn hợp (tế bào – plasmid) sang bể ủ nhiệt ở 42 oC trong 30 giây và đặt trên đá trong 2 phút. Tiếp đó bổ sung 1ml môi trường SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression) đã được làm ấm và đặt trong tủ ủ lắc ở 37 oC, 200 rpm trong 1 giờ. Sau đó cấy trải dịch nuôi cấy với độ pha loãng 1:10 và 1:100 trong môi trường chọn lọc LB có chứa ampicillin ở nhiệt độ 37 oC trong 16 giờ. Đoạn DNA pUC19 được dùng làm đối chứng dương cho quá trình cloning. Những dòng dương tính (positive clones) được chọn lựa và kiểm tra bằng phương pháp PCR với đoạn primer LpJET1.2F (5’CTGCTTTAACACTTGTGCCTGA 3′) và LpJET1.2R (5’ TTCCTGATGAGGTGGTTAGCAT 3′). Các đoạn chèn được giải trình tự tại công ty First Base, Malaysia. So sánh trình tự của các đoạn chèn bằng phần mềm BLAST với cơ sở dữ liệu miRBase ( Bảng 2. 2. Trình tự đoạn primer sử dụng trong phương pháp Nested RT-PCR Đoạn Tài liệu tham khảo Trình tự primer P1 5’ CACCGCCTGTAAAGAGGAGATGT 3’ (Campo và ctv., 2013) P2 5’ CGTTTTTGGGGTCACTACTGGA 3’ P3 5’ GAGTAAAATGCACTAGCGGTCCT 3’ P4 5’ GAGTAAAATACACCAGCGGTTCT 3’ OsUbi1-F 5’ CACCTTGGCTGACTACAACATCCA 3’ OsUbi1-R 5’ TGCTTACCAGCAAAGATCAGACGC 3’
50. 33 Hình 2.1. Trình tự và vị trí bắt cặp của 2 cặp primer (P1,P2) và (P3,P4) trong phản ứng Nested RT-PCR. Chú thích: Do tiền phân tử osa-miR7695 (precursor osa-miR7695) có trình tự khá dài (487 bp), do vậy kỹ thuật Nested RT-PCR được tiến hành với 2 cặp primer (P1,P2) (bên ngoài) và (P3,P4) (bên trong) để tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR.
51. 34 2.4.4. Phương pháp xác định sự biển hiện của phân tử osa-miR7695, osa- miR169a, osa-miR160a và OsNramp6 trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm. Mức độ biểu hiện của phân tử osa-miR7695, osa-miR169a, osa-miR160a và phân tử OsNramp6.4 được đánh giá bằng phương pháp real-time quantitative PCR (qPCR) với kít SensiFAST SYBR No-ROX (Bioline, UK) (Phụ lục 4). Trình tự các primer sử dụng cho phản ứng qPCR được thể hiện trong Bảng 2.3. Phản ứng Real- time PCR được thực hiện bằng thiết bị Mygo Pro (IT-IS Life Science Ltd, UK) ở chu trình như sau: biến tính ban đầu 95 oC trong 2 phút, 40 chu kỳ bao gồm (biến tính 95 oC trong 10s, bắt cặp ở 65 oC trong 10s, kéo dài ở 72 oC trong 20s) và bảo quản sản phẩm lạnh ở nhiệt độ 10oC. Gen OsUbi1 được sử dụng làm đối chứng nội như mô tả trong nghiên cứu trước đây (Campo và ctv., 2013). So sánh tương đối mức độ biểu hiện của osa-miR7695, osa-miR169a, osa-miR160a và OsNramp6.4 được ước lượng bằng phương pháp 2-ΔCt. Giá trị chu kỳ ngưỡng (threshold cycle – Ct) là con số chu kỳ mà ở đó giá trị Ct tương quan ngược với nồng độ mẫu ban đầu. Điều đó có nghĩa là mẫu có nồng độ DNA ban đầu thấp thì sẽ có số chu kỳ cao, tức là Ct cao. Tương tự, mẫu với nồng độ ban đầu cao thì cần số chu kỳ thấp, tức là giá trị Ct thấp. Mức -ΔCt độ biểu hiện có thể được đánh giá bằng giá trị 2 với ΔCt = CT của mẫu – CT của OsUbi1. Mỗi phản ứng được lặp lại 3 lần và ghi nhận dữ liệu bằng công thức : trung bình ± độ lệch chuẩn (Standard deviation - SD). Bảng 2.3. Trình tự đoạn primer sử dụng trong phản ứng Real-time PCR (osa- miR7695). Tên đoạn Trình tự Tài primer liệu tham khảo qPCR-OsUbi1-F 5’ CACCTTGGCTGACTACAACATCCA 3’ (Campo qPCR-OsUbi1-R 5’ TGCTTACCAGCAAAGATCAGACGC 3’ và ctv., OsNramp6.4 - F 5’ ACATGTGGGTCCAAGCTCAAC 3’ 2013)
52. 35 OsNramp6.4 - R 5’ GAGTGCTTATTTGCCCTTGGC 3′ Osa-miR7695-F 5’ CGCGGATCCCACCGCCTGTAAAGAG Trong GAGATGT 3’ nghiên Osa-miR7695-R 5’ CGCCCCGGGCGTTTTTGGGGTCACTACT cứu này GGA 3’ Osa-miR169a - 5’ F ACAGGTACCTGATTCGCTGACGATGCACAG 3’ Osa-miR169a - 5’ R ACAGTCGACTGAATTGAATTTGGAAGGCCC TG 3’ osa-miR160a-F 5’GTGCCTGGCTCCCTGTATG3’ osa-miR160a-R 5’TTGCACGCCACCCAGTAG3’ 2.4.5. Phương pháp xác định sự biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6 Để nhận biết sự biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6 ở nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae, kỹ thuật real-time PCR được sử dụng với chiết xuất lá lúa bị nhiễm M. oryzae ở các thời điểm khác nhau (24 hpi, 48 hpi, 72 hpi). Phương pháp tiến hành tương tự như phương pháp xác định sự biểu hiện của phân tử osa-miR7695 (phía trên) với các đoạn primer được thiết kế đặc hiệu cho các biến thể phiên mã OsNramp6 (Bảng 2.4). Trước khi tiến hành phân tích biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6, các đoạn primer đặc hiệu được thiết kế dựa trên các trình tự vùng mã hóa CDS thu được từ ngân hàng Genbank. Trong đó OsNramp6 có 8 biến thể phiên mã lần lượt là LOC_Os01g31870.1, LOC_Os01g31870.2, LOC_Os01g31870.3, LOC_Os01g31870.4, LOC_Os01g31870.5, LOC_Os01g31870.6, LOC_Os01g31870.7, LOC_Os01g31870.8. Sau khi tiến hành gióng hàng các đoạn trình tự biến thể này với
53. 36 trình tự tham chiếu của OsNramp6 để xác định các đoạn trình tự chuyên biệt cho mỗi biến thể phiên mã. Hai biến thể LOC_Os01g31870.2, LOC_Os01g31870.3 có chung một đoạn trình tự chuyên biệt và ba biến thể LOC_Os01g31870.5, LOC_Os01g31870.6, LOC_Os01g31870.7 cũng có chung một đoạn trình tự chuyên biệt nên được lựa chọn để xây dựng cặp primer phát hiện chung cho các biển thể này lần lượt là OsNramp6.23 và OsNramp6.567. Các biến thể còn lại OsNramp6.1, OsNramp6.4, OsNramp6.8 được thiết kế chuyên biệt dựa trên các trình tự đã phát hiện. Các đoạn primer qPCR chuyên biệt trên được xây dựng trên phần mềm Primer3 dựa trên sự bắt cặp của các liên kết hydro với SYBR. Bảng 2.4. Danh sách trình tự các đoạn primer cho phản ứng Real time PCR để xác định sự biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6. Tên đoạn Primer Trình tự Tài liệu tham khảo qPCR-OsUbi1-F 5’ CACCTTGGCTGACTACAACATCCA 3’ Campo qPCR-OsUbi1-R 5’ TGCTTACCAGCAAAGATCAGACGC 3’ và ctv., 2013 OsNramp6.1-F 5’ GCAGCCTATATTGCTGCTCTG 3’ OsNramp6.1-R 5’ AATCTCACCAGAAACTGAATTGG 3’ OsNramp6.23-F 5’ CCATCGCATACCTTGATCCT 3’ OsNramp6.23-R 5’ CCCAAATAGGAGTACCCATAGC 3’ Trong OsNramp6.04-F 5’ TCTCCGGAATGAGAAAGTGC 3’ nghiên OsNramp6.04-R 5’ AAGTACCACCAATGCTGCAA 3’ cứu này. OsNramp6.567-F 5’ AACTGTGTATGGTGTGGCCTTA 3’ OsNramp6.567-R 5’ AAATGTACCTGCATGATGTATTGG 3’ OsNramp6.8-F 5’ GCTACTCCACATCCCTTTCTG 3’ OsNramp6.8-R 5’ GCAGAGAAAAATTCTTACCCCATA 3’
54. 37 2.4.6. Phương pháp xác định microRNA tiềm năng Trình tự của các biển thể phiên mã của gen OsNramp6 được thu nhận từ ngân hàng Genbank dưới định dạng FASTA. Các trình tự này được đưa vào phần mềm psRNATarget V2 ( với mức độ giới hạn trên (1000miB) để nhận diện các microRNA ở lúa có sự bắt cặp tương đồng với vùng 5’UTR của các biến thể phiên mã của gen OsNramp6, sử dụng giản đồ ghi điểm có sẵn (predefined scoring schema) kết hợp với dữ liệu của miRBase (Dai và ctv., 2018). 2.4.7. Phương pháp phân tích thống kê Số liệu được phân tích thống kê so sánh đa biến với phương pháp Tukey’s test. Kiểm tra sự khác biệt giữa giống lúa chống chịu và mẫn cảm bằng phương pháp kiểm định giả thuyết t test và bác bỏ giả thuyết H0 ở mức độ ý nghĩa thống kê P ≤ 0,05. Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Mức độ đặc hiệu, độ nhạy của giá trị 2-ΔCt (osa-miR7695, osa-miR169a, OsNramp6) khi so sánh giữa nhóm chống chịu và nhóm mẫn cảm, được xác định dựa trên phương pháp phân tích đường cong ROC (Receiver Operating Characteristic) (Fawcett, 2006). Phương pháp phân tích đường cong ROC đã được sử dụng khá nhiều trong các nghiên cứu ở rất nhiều lĩnh vực như: hàng không, giáo dục, nông nghiệp và đặc biệt là y khoa (Obuchowski và Bullen, 2018). Phương pháp ROC xác định mức độ đặc hiệu và độ nhạy dựa trên tỷ lệ dương tính giả và tỷ lệ âm tính giả (Fawcett, 2006). Dựa trên phương trình hồi quy logistic, phương pháp ROC xây dựng được đường cong ROC, trong đó mức độ đặc hiệu và độ nhạy được xác định bằng giá trị bên dưới đường cong ROC, area under the curve (AUC). Giá trị AUC dao động từ 0,5 đến 1, tương ứng với độ nhạy và độ đặc hiệu dao động từ thấp (0,5) đến cao (1) (Fawcett, 2006). Phương pháp phân tích ROC được tính toán phần mềm dựa trên nền web ( hoặc phần mềm Graphpad Prism 8.4.3 (Graphpad software, Inc., San Diego, CA). Số liệu của các thí nghiệm được tính toán và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và phần mềm Graphpad Prism 8.4.3 (Graphpad software, Inc., San Diego, CA).
55. 38 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định nấm M. oryzae trên các giống lúa bằng phương pháp PCR. Từ các nguồn mẫu lúa biểu hiện nhiễm bệnh đạo ôn, ít nhất 7 mẫu nấm bệnh bao gồm 4 mẫu phân lập từ lá và 3 mẫu phân lập từ cổ bông được sử dụng để tiến hành quan sát đặc điểm hình thái cấu trúc xâm nhiễm chuyên biệt của nấm M. oryzae. Để đánh giá khả năng gây bệnh của các mẫu nấm nghiên cứu thì việc đánh giá khả năng hình thành các cấu trúc xâm nhiễm của nấm gây bệnh đạo ôn bao gồm số lượng bào tử, tỉ lệ nảy mầm và hình thành giác bám là những yếu tố quan trọng cần xác định cho mục đích đánh giá khả năng gây bệnh của nấm M. oryzae trên cây lúa. Trong thí nghiệm này hình thái bào tử của tất cả các mẫu nấm phân lập được quan sát sau khi cấy nấm trên môi trường OMA (oat meal agar) và được kích thích hình thành bào tử dưới bước sóng khoảng 300-400 nm của đèn UV. Kết quả nghiên cứu cho thấy có nhiều hình dạng bào tử khác nhau từ các mẫu nấm phân lập được. Sự đa dạng hình thái bào tử này là do lá nhiễm bệnh đạo ôn không chỉ có sự hiện diện của M. oryzae mà còn nhiều nấm gây bệnh khác có triệu chứng gây bệnh trên lúa giống như đạo ôn như Curvularia luneta, Bipolaris oryzae. Tuy nhiên, ít nhất hai mẫu nấm trong đó một mẫu phân lập từ lá nhiễm tại Đồng Nai (LĐN) và cổ bông nhiễm tại Tiền Giang (CBTG) có hình thái bào tử giống nấm gây bệnh đạo ôn với hình dạng bầu dục hoặc thuôn dài và có hai vách ngăn đặc trưng (Hình 3.1) (Hamer và ctv., 1988; Counch và Kohn, 2002). Để tìm hiểu khả năng hình thành các cấu trúc xâm nhiễm, bào tử của LĐN và CBTG được kích thích và quan sát trên tấm lam kính như một bề mặt nhân tạo và ủ trong môi trường tối, ẩm. Kết quả chỉ ra rằng sau 6 giờ, trên 95% bào tử đều có hiện tượng nảy mầm và trong đó hơn 80% số bào tử nảy mầm này có hình thành giác bám trên bề mặt nhân tạo được quan sát thấy trên hai mẫu nấm (Hình 3.2). Trong thí nghiệm lam kính được sử dụng như bề mặt nhân tạo để quan sát khả năng hình thành giác bám (appresoria) của bào tử nấm gây bệnh đạo ôn nên tỉ lệ hình thành giác bám sẽ thấp hơn so với bề mặt nhân tạo gần giống với lá lúa hơn hoặc trực tiếp trên lá. Tuy nhiên với tỉ lệ quan sát cao như trên chúng tôi có thể kết luận là sức
56. 39 sống của hai mẫu nấm này khá cao và khả năng gây bệnh bằng các cấu trúc xâm nhiễm trên của chúng là khá mạnh. Dựa trên kết quả hình thái của hai mẫu nấm LĐN và CBTG có thể ban đầu kết luận chúng là nấm gây bệnh đạo ôn, M. oryzae. Phát hiện này sẽ giúp ích rất nhiều trong các thí nghiệm về sau liên quan đến khả năng lây bệnh của chúng trong quá trình lây bệnh trên cây trồng hay làm nguồn vật liệu cho việc nghiên cứu sâu hơn về phân tích chức năng của các gen gây bệnh ở mức độ toàn hệ gen của nấm gây bệnh đạo ôn hoặc ảnh hưởng của di truyền biểu sinh đến tính kháng của cây lúa đối với nấm gây bệnh đạo ôn. Hình 3.1. Hình thái bào tử của hai mẫu nấm phân lập từ lá và cổ bông biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn. Chú thích: LĐN: mẫu nấm phân lập từ lá lúa nhiễm đạo ôn tại Đồng Nai. CBTG: mẫu nấm phân lập từ cổ bông lúa nhiễm đạo ôn tại Tiền Giang.
57. 40 Hình 3.2. Sự hình thành các cấu trúc xâm nhiễm của mẫu nấm gây bệnh đạo ôn phân lập được sau các thời gian quan sát khác nhau. (c) bào tử, (g) nảy mầm, (a) giác bám (appressorium). Để khẳng định thêm chính xác rằng hai mẫu nấm phân lập và đánh giá trên có phải là nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, M. oryzae hay không, phương pháp PCR đã được sử dụng với cặp primer Pot2 transposon đã được nghiên cứu trên các chủng nấm M. oryzae gây bệnh đạo ôn trên loài cỏ chum trước đây (Harmon và ctv., 2003; Kachroo và ctv., 2000). Kết quả phân tích trình tự cho thấy đoạn primer Pot2 dùng trong nghiên cứu này khuếch đại đoạn DNA đặc trưng cho nấm gây bệnh đạo ôn M. oryzae có chiều dài là 687 bp nằm trong vùng có trình tự từ vị trí 1055 đến 1741 trong
58. 41 tổng số 1861 bp của gen Pot2 transposon trên. Trong nghiên cứu này, DNA của hai mẫu nấm được phân lập từ lá nhiễm bệnh đạo ôn (LĐN) và cổ bông nhiễm bệnh đạo ôn (CBTG) được ly trích, thu nhận và tinh sạch để làm nguồn vật liệu cho phản ứng PCR. Đồng thời, hai mẫu nhiễm bệnh bao gồm lá nhiễm đạo ôn (LN) và cổ bông nhiễm đạo ôn (CBN) được thu thập trên đồng ruộng cũng được ly trích, thu nhận DNA để đánh giá thêm khả năng ứng dụng của phương pháp PCR kết hợp với primer Pot2 trong việc phát hiện và xác định nấm gây bệnh đạo ôn trên đồng ruộng (Hình 3.3). Để đánh giá tính chuyên biệt của cặp primer Pot2 transposon trong việc phát hiện M. oryzae, hai mẫu nấm có hình thái bào tử khác biệt so với bào tử của nấm gây bệnh đạo ôn (nấm 1, nấm 2) được sử dụng như là mẫu đối chứng âm vì trình tự khuếch đại của primer Pot2 tranposon được mô tả là tương đồng cao trên nấm gây bệnh đạo ôn nhưng không cao trên các mẫu nấm khác cho nên khả năng primer bắt cặp và khuếch đại trên hệ gen của nấm gây bệnh đạo ôn sẽ chuyên biệt hơn (Harmon và ctv., 2003). Dựa trên phân tích hình thái có thể xác định được hai mẫu nấm 1 và nấm 2 lần lượt là Curvularia lunata và Fusarium spp. Kết quả nghiên cứu ở Hình 3.3 cho thấy giếng số 2 và số 3 tương ứng với các mẫu DNA từ các chủng nấm gây bệnh đạo ôn LĐN, CBTG khi tham gia phản ứng PCR với cặp primer Pot2 đều cho sản phẩm khuếch đại với giá trị băng khuếch đại khoảng gần 800 bp. Mẫu LN và CBN (tương ứng giếng số 4 và số 5) nhiễm nấm gây bệnh đạo ôn đều cho sản phẩm băng khuếch đại PCR với kích thước tương tự như hai mẫu nấm gây bệnh đạo ôn trên. Điều này cho thấy có sự hiện diện của nấm gây bệnh đạo ôn trên mẫu lá và cổ bông bị nhiễm. Riêng các mẫu DNA của nấm 1 và nấm 2 tương ứng với giếng số 6 và số 7 là những mẫu nấm không phải là nấm gây bệnh đạo ôn thì kết quả PCR đã chỉ ra không có băng sản phẩm khuếch đại khi dùng đoạn primer Pot2 transposon. Kết quả giải trình tự hai chiều DNA sản phẩm PCR bằng cặp primer Pot2 transposon và so sánh với dữ liệu gen trên NCBI bằng công cụ BLAST nucleotide đã chỉ ra rằng trình tự DNA sản phẩm PCR của các mẫu nấm phân lập từ lá, cổ bông lúa và mẫu lá, cổ bông nhiễm đạo ôn trên đều là Pot2 transposon của M. oryzae (Hình 3.4, Hình 3.5). Điều này cho
59. 42 thấy tính chuyên biệt của Pot2 transposon trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn cũng như trong việc chẩn đoán bệnh đạo ôn trên đồng ruộng và trong phòng thí nghiệm. Độ tin cậy của quy trình này đã được kiểm chứng trên một số chủng nấm gây bệnh đạo ôn được phân lập từ lá và cổ bông của lúa nhiễm ở miền Nam, miền Trung và miền Bắc Việt Nam. Sự hiện diện sản phẩm PCR của Pot2 tranposon từ các mẫu nấm phân lập này đã giúp kết luận chúng là nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, M. oryzae và quy trình này có thể được sử dụng để khẳng định sự hiện diện của nấm gây bệnh đạo ôn trong các thí nghiệm sau. Việc phân lập và xác định nấm gây bệnh đạo ôn bằng phương pháp PCR có ý nghĩa rất lớn không chỉ trong việc phát hiện nhanh, kịp thời bệnh đạo ôn trên lúa mà còn giúp giảm rất nhiều thời gian và công sức trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn. Nếu so với phương pháp truyền thống vốn mất từ 1 đến 2 ngày để quan sát sự xuất hiện của bào tử M. oryzae dưới kính hiển vi thì phương pháp này chỉ mất 5 giờ đồng hồ từ khâu chiết xuất nhanh DNA, phản ứng PCR, điện di và chụp ảnh.
60. 43 Hình 3.3. Tính chuyên biệt của cặp primer Pot2 tranposon trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn và trong chẩn đoán bệnh đạo ôn trên đồng ruộng. Chú thích: LD1kb: HyperLadderTM 1 kb (Bioline, Hoa Kỳ); LĐN: mẫu nấm chiết xuất từ lá biểu hiện triệu chứng đạo ôn thu tại Đồng Nai; CBTG: mẫu nấm chiết xuất từ cổ bông biểu hiện triệu chứng đạo ôn thu tại Tiền Giang; LN: Lá lúa biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn; CBN: Cổ bông lúa biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn; MN1: mẫu nấm bệnh cây1; MN2: mẫu nấm bệnh cây 2; -PCR: Đối chứng âm (sử dụng nước)
61. 44 Hình 3.4. Kết quả BLAST trình tự DNA sản phẩm PCR bằng cặp primer Pot2 transposon của mẫu nấm gây bệnh đạo ôn phân lập từ lá lúa nhiễm bệnh tại Đồng Nai (LĐN) và lá lúa biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn trên cơ sở dữ liệu DNA của NCBI.
62. 45 Hình 3.5. Kết quả BLAST trình tự DNA sản phẩm PCR bằng cặp primer Pot2 transposon của mẫu nấm gây bệnh đạo ôn phân lập từ lá lúa nhiễm bệnh đạo ôn (LN) và lá lúa biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn trên cơ sở dữ liệu DNA của NCBI.
63. 46 3.2. Đánh giá khả năng chống chịu/mẫn cảm với nấm M. oryzae trên các giống lúa thí nghiệm. Để đánh giá giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, phương pháp nhiễm bào tử nấm M. oryzae LBT2 được thực hiện trên 19 giống lúa trồng ở Việt Nam (Quoc và ctv., 2019). Sau 5-7 ngày lây nhiễm, 3 lá của mỗi giống lúa được thu thập và phân tích bằng phần mềm Access 2.0 (Phần mềm phân tích hình ảnh mức độ bệnh ở cây trồng (American Phytopathology Society, USA). Sự thay đổi phần trăm diện tích lá bệnh được quan sát ở cây lúa sẽ được đánh giá và phân loại vào nhóm chống chịu hoặc mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn để phục vụ cho các nghiên cứu sau. Kết quả phân tích tỉ lệ nhiễm trung bình trên lá ở các giống lúa bằng phần mềm Access 2.0 chỉ ra rằng có sự đa dạng về mức độ nhiễm trên các giống lúa khác nhau đối với nấm M. oryzae. Tỉ lệ nhiễm trên các giống lúa nghiên cứu trải đều từ 4,02% đến 89,21%, trong đó OM8017 là giống có tỉ lệ nhiễm thấp nhất và OM7347 có tỉ lệ nhiễm cao nhất (Hình 3.6, Bảng 3.1). Nghiên cứu cũng cho thấy số lượng các giống có tỉ lệ nhiễm thấp đại diện cho tính kháng mạnh là khá thấp với 6/19 giống có tỉ lệ nhiễm dưới 25% và 13 giống còn lại có tỉ lệ nhiễm khá cao chủ yếu tập trung trong khoảng 31% - 45%. Để tiến hành phân tích về mặt phân tử các giống lúa có tỉ lệ nhiễm dưới 25% sẽ được xếp vào nhóm lúa chống chịu và các giống có tỉ lệ cao hơn được xếp vào nhóm mẫn cảm dựa trên kết quả nghiên cứu của Campos‐Soriano và ctv. (2020). Kết quả phân nhóm bao gồm 2 nhóm với nhóm chống chịu (ST5, OM8017, RVT, Gold Carolina, IR50404, và OM5451) và nhóm mẫn cảm (OM6162, OM9921, Nang Hoa 9, OM2517, OM9582, Jasmine85, OM4900, OM576, BC15, OM344, OM6976, OM4218, và OM7347). Trong đó, nhóm mẫn cảm có mức độ nhiễm trung bình đạt 51,94% gấp 3 lần so với nhóm kháng chỉ là 14,49%, điều này cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức độ xâm nhiễm của nấm M. oryzae giữa nhóm chống chịu và nhóm mẫn cảm (P < 0,001) (Bảng 3.1) (Phụ lục 6).