Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu một số chỉ thị trên nhiễm sắc thể Y để ứng dụng trong giám định pháp y

1. BỘ GIÁO D ỤC VÀ ĐÀO T ẠO VI ỆN HÀN LÂM KHOA H ỌC VÀ CÔNG NGH Ệ VI ỆT NAM HỌC VI ỆN KHOA H ỌC VÀ CÔNG NGH Ệ HÀ H ỮU H ẢO NGHIÊN C ỨU M ỘT S Ố CH Ỉ TH Ị TRÊN NHI ỄM S ẮC TH Ể Y ĐỂ ỨNG D ỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH PHÁP Y Chuyên ngành: Công ngh ệ sinh h ọc Mã s ố: 9.42.02.01 TÓM T ẮT LU ẬN ÁN TI ẾN S Ĩ CÔNG NGH Ệ SINH H ỌC Hà N ội - 2023
2. Công trình được hoàn thành t ại: H ọc vi ện Khoa h ọc và Công ngh ệ - Vi ện Hàn lâm Khoa h ọc và Công ngh ệ Vi ệt Nam. Ng ười h ướng d ẫn khoa h ọc 1: GS.TS. Chu Hoàng Hà Ng ười h ướng d ẫn khoa h ọc 2: PGS.TS. Lê V ăn S ơn Ph ản bi ện 1: Ph ản bi ện 2: Ph ản bi ện 3: . Lu ận án s ẽ được b ảo v ệ tr ước H ội đồng đánh giá lu ận án ti ến s ĩ cấp H ọc vi ện, h ọp t ại H ọc vi ện Khoa học và Công ngh ệ - Vi ện Hàn lâm Khoa h ọc và Công ngh ệ Vi ệt Nam vào h ồi gi ờ ’, ngày tháng n ăm 202 Có th ể tìm hi ểu lu ận án t ại: - Th ư vi ện H ọc vi ện Khoa h ọc và Công ngh ệ - Th ư vi ện Qu ốc gia Vi ệt Nam
3. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính c ấp thi ết c ủa lu ận án Bắt đầu t ừ năm 1953 v ới s ự ki ện Watson và Crick phát hi ện ra cấu trúc xo ắn kép c ủa ADN cho đến nay, công ngh ệ sinh h ọc phân t ử đã có nh ững b ước phát tri ển v ượt b ậc và tr ở thành công c ụ hữu hi ệu cho nhi ều ngành khoa h ọc khác nhau nh ư y h ọc, nông nghi ệp, kh ảo c ổ học, pháp y Đặc bi ệt, trong lĩnh v ực giám định pháp y, khoa h ọc hình s ự công ngh ệ ADN cũng đóng vai trò quan tr ọng để gi ải quy ết các v ụ vi ệc nh ư điều tra xác định danh tính tội ph ạm, xét nghi ệm các m ối quan h ệ huy ết th ống, tìm ng ười m ất tích Phân tích ADN giúp gi ải quy ết t ừ nh ững v ụ vi ệc mang tính dân s ự nh ư xác định cha cho con, tranh ch ấp quy ền th ừa k ế đến các v ụ án hình s ự ADN là b ằng ch ứng có tính pháp lý cao và có giá tr ị quy ết định trong các phiên toà. H ơn th ế nữa, trong nh ững v ụ thiên tai, th ảm ho ạ với s ố lượng ng ười t ử vong l ớn hay khi vi ệc nh ạn d ạng thông th ường không th ể th ực hi ện thì giám định ADN để xác định danh tính n ạn nhân tr ở thành bi ện pháp kh ả thi nh ất. Vi ệc lựa ch ọn các ch ỉ th ị phân t ử là các đoạn gen (locus gen) có tính b ền v ững, đa hình cao, mang đặc tr ưng cho t ừng cá th ể là điều quan tr ọng nh ằm ứng d ụng phân tích ADN trong khoa h ọc điều tra, pháp y. Trong s ố đó, các đoạn l ặp l ại ng ắn - STR (short tandem repeat) - là nh ững trình t ự ADN lặp l ại liên ti ếp với m ỗi đơ n v ị lặp l ại g ồm 1 - 6 bp đã được nghiên c ứu, l ựa ch ọn và tr ở thành ch ỉ th ị phân t ử ph ổ bi ến nh ất hi ện nay. Các locus STR đã được kh ảo sát, h ệ thống l ại t ạo thành các b ộ kit th ươ ng ph ẩm v ới kh ả năng đồng th ời nhi ều locus STR m ột cách nhanh chóng, chính xác, có độ nh ạy cao. Song song v ới các locus STR trên c ặp nhi ễm s ắc th ể (NST) th ường, vi ệc nghiên c ứu ứng d ụng các locus STR trên NST gi ới tính X và Y c ũng đang thu hút s ự quan tâm c ủa các nhà khoa h ọc. Các STR trên NST gi ới tính Y (g ọi t ắt là Y-STR) có đặc điểm chính là ch ỉ di truy ền theo dòng cha mà không có s ự tái t ổ hợp qua các th ế hệ do đó gi ữa các cá th ể nam gi ới cùng dòng cha s ẽ có h ồ sơ Y-STR gi ống nhau. Khi vi ệc sử dụng các STR trên NST th ường không th ể đáp ứng được yêu c ầu giám định, phân tích thêm h ồ sơ Y- STR sẽ giúp gi ải quy ết nhi ều tr ường h ợp, đặc bi ệt là giám định ADN đối v ới các m ẫu t ừ nam gi ới nh ư xác định mối quan h ệ theo dòng cha (anh - em trai, chú – cháu ), các v ụ án hi ếp dâm v ới nghi ph ạm nam gi ới, lập ph ả hệ di truy ền theo dòng cha Hi ện nay phân tích Y-STR ch ủ yếu th ực hi ện qua các b ộ kit th ươ ng m ại hoá mà ph ổ bi ến nh ất là bộ PowerPlex® Y23 system (hãng Promega) với 23 Y-STR và bộ Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (hãng Thermo Fisher Scientific) phân tích 27 Y-STR. Hai b ộ kit t ỏ rõ h ữu hi ệu v ới nhi ều ứng d ụng khác nhau: phân bi ệt cá th ể nam trong qu ần th ể, xác định quan h ệ huy ết th ống theo dòng cha, giám định hình s ự trên m ẫu có n ồng độ ADN th ấp, m ẫu l ẫn t ừ nhi ều ngu ồn, m ẫu vi v ết. Do c ấu trúc di truy ền c ủa t ừng qu ần th ể là khác nhau nên vi ệc đánh giá độ đa hình, tính phù h ợp c ủa các STR nói chung và Y-STR nói riêng là điều c ần thi ết tr ước khi áp d ụng trong qu ần th ể. M ỗi phòng thí nghi ệm, vi ện nghiên c ứu được khuy ến cáo nên xây d ựng b ảng t ần su ất phân b ố các alen v ới t ừng qu ần th ể ng ười khác nhau nh ằm ph ục v ụ cho vi ệc tính toán độ tin c ậy, xác su ất có quan h ệ huy ết th ống. Vi ệc s ử dụng các b ộ kit trên để nghiên c ứu và ứng d ụng các ch ỉ th ị Y-STR trong khoa h ọc k ỹ thu ật, hình s ự, giám định huy ết th ống đã được áp d ụng ph ổ bi ến trên th ế gi ới. Tuy v ậy t ại Vi ệt Nam hi ện nay v ẫn 1
4. 2 ch ưa có nhi ều nghiên c ứu chi ti ết để kh ảo sát t ần su ất phân b ố, độ đa hình, tính phù h ợp, kh ả năng ứng d ụng của các ch ỉ th ị Y-STR trên qu ần th ể đại di ện cho nam gi ới ng ười Vi ệt. Các nghiên c ứu m ới ch ỉ dừng l ại ở số ít các ch ỉ th ị trên quy mô m ẫu nh ỏ. Vi ệc kh ảo sát thêm các locus Y-STR nh ằm ph ục v ụ cho vi ệc tính toán độ tin c ậy h ồ sơ Y-STR, xác su ất có quan h ệ theo dòng cha, ứng d ụng trong khoa h ọc hình s ự là th ực sự cần thi ết và có ý ngh ĩa th ực ti ễn cao. Vì v ậy chúng tôi ti ến hành th ực hi ện đề tài “ Nghiên c ứu m ột s ố ch ỉ th ị trên nhi ễm s ắc th ể Y để ứng d ụng trong giám định pháp y ” 2. M ục tiêu nghiên c ứu c ủa lu ận án - Lựa ch ọn và nghiên c ứu các đặc điểm liên quan (t ần su ất phân b ố alen, độ đa hình, kh ả năng phân bi ệt cá th ể ) c ủa 29 ch ỉ th ị Y-STR trong qu ần th ể nam gi ới Vi ệt Nam dân t ộc Kinh. - Nghiên c ứu m ột s ố ch ỉ th ị có kích th ước nh ỏ (mini STR) trên NST Y. - Kh ảo sát ti ềm n ăng ứng d ụng c ủa các ch ỉ th ị Y-STR trên nhi ều lo ại m ẫu khác nhau (m ẫu l ẫn, m ẫu có ch ất l ượng kém, m ẫu đã phân h ủy). 3. Các n ội dung nghiên c ứu chính c ủa lu ận án Để đạt được m ục tiêu c ủa đề tài, chúng tôi đã th ực hi ện các n ội dung nghiên c ứu chính sau: - Lựa ch ọn đối t ượng nghiên c ứu, ti ến hành thu th ập m ẫu và tách chi ết ADN. - Th ực hi ện quy trình phân tích ch ỉ th ị Y-STR t ừ các m ẫu nghiên c ứu. L ập b ảng phân b ố tần su ất alen c ủa các ch ỉ th ị locus Y-STR và tính toán các ch ỉ số liên quan: s ố alen, độ đa hình, độ đa d ạng haplotype, kh ả năng phân bi ệt cá th ể. - Lựa ch ọn và t ối ưu điều ki ện khu ếch đại m ột s ố mini STR trên NST Y và b ước đầu ứng d ụng trong công tác giám định ADN. - Kh ảo sát kh ả năng t ạo ch ỉ th ị Y-STR trên nhi ều lo ại m ẫu giám định khác nhau nh ư m ẫu l ẫn t ừ nhi ều ngu ồn, m ẫu hài c ốt lâu n ăm, m ẫu vi v ết. 2
5. 3 CH ƯƠ NG 1. T ỔNG QUAN 1.1. Phân tích ADN trong giám định pháp y 1.2. Các lo ại ch ỉ th ị phân t ử (marker) 1.3. Tổng quan ch ỉ th ị STR 1.3.1. Đặc điểm trong b ộ gen 1.3.2. Phân lo ại STR 1.4. STR trên nhi ễm s ắc th ể gi ới tính Y 1.5. Các h ướng ứng d ụng c ủa ch ỉ th ị STR trên nhi ễm s ắc th ể gi ới tính Y 1.5.1. Y-STR trong nghiên c ứu c ấu trúc di truy ền qu ần th ể (genetic structure) 1.5.2. Ứng d ụng các Y-STR trong xác định huy ết th ống 1.5.3. Ứng d ụng c ủa các Y-STR trong l ĩnh v ực khoa h ọc hình s ự 1.6. Ph ươ ng pháp phân tích các ch ỉ th ị Y-STR 1.6.1. Phân tích d ựa trên ph ươ ng pháp điện di mao qu ản 1.6.2. Phân tích s ử dụng các b ộ kit Y-STR th ươ ng m ại hóa 1.6.3. Phân tích s ử dụng chi ến l ược mini STR 1.7. Tầm quan tr ọng c ủa vi ệc tính toán t ần su ất alen các ch ỉ th ị STR 1.8. Tình hình nghiên c ứu các ch ỉ th ị Y-STR 1.8.1. Tình hình nghiên c ứu trên th ế gi ới 1.8.2. Tình hình nghiên c ứu t ại Vi ệt Nam CH ƯƠ NG 2. ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C ỨU 2.1. Đối t ượng nghiên c ứu - Nghiên c ứu kh ảo sát đa hình locus Y-STR thu ộc b ộ kit PowerPlex® Y23 System và Yfiler Plus: 400 m ẫu nam gi ới dân t ộc Kinh được thu th ập ở mi ền b ắc Vi ệt Nam, không có quan h ệ huy ết th ống v ới nhau. Mẫu được thu bao g ồm: m ẫu tóc, niêm m ạc mi ệng ho ặc m ẫu máu - Nghiên c ứu trên m ẫu đã b ị phân hu ỷ: 30 m ẫu x ươ ng hài c ốt được thu th ập t ừ: Ngh ĩa trang li ệt s ĩ Hữu Ngh ị Vi ệt Lào, huy ện Anh S ơn, t ỉnh Ngh ệ An (15 m ẫu) và Ngh ĩa trang li ệt s ĩ huy ện Định Hóa, t ỉnh Thái Nguyên (15 m ẫu). - Nghiên c ứu trên m ẫu l ẫn (mixture sample): 50 m ẫu d ịch âm đạo thu t ừ nạn nhân n ữ trong nh ững vụ án hi ếp dâm được cung c ấp b ởi c ơ quan công an các t ỉnh, thành ph ố tr ưng c ầu giám định ADN tại Khoa Y sinh h ọc – Vi ện Pháp y qu ốc gia. 2.2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu 2.2.1. Ph ươ ng pháp tách chi ết ADN Đề tài s ử dụng 3 ph ươ ng pháp tách chi ết ADN tùy thu ộc t ừng lo ại m ẫu và m ục đích nghiên c ứu: - Ph ươ ng pháp tách chi ết ADN bằng Chelex ® 100: Đây là ph ươ ng pháp tách chi ết s ử dụng đối v ới các m ẫu thông th ường nh ư: máu, lông, tóc và c ả mẫu mô ch ưa b ị phân h ủy. - Ph ươ ng pháp tách chi ết ADN bằng Qiamp ® ADN micro kit: Ph ươ ng pháp này được s ử dụng đối với các m ẫu có n ồng độ ADN th ấp, m ẫu thu th ập t ại hi ện tr ường các v ụ án và khó tách chi ết ADN. 3
6. 4 - Ph ươ ng pháp tách chi ết ADN bằng QIAamp ® ADN investigator kit c ủa hãng QIAgen – Đức: Ph ươ ng pháp này được s ử dụng đối v ới các m ẫu x ươ ng, r ăng hài c ốt đã b ị phân hu ỷ, có n ồng độ ADN th ấp, ADN bị đứt gãy nhi ều. 2.2.2. Ph ươ ng pháp định l ượng ADN - Với mẫu tách chi ết theo ph ươ ng pháp Chelex ® 100: Đo n ồng độ ADN sau tách chi ết b ằng máy Quantus Fluorometer (Promega) theo h ướng d ẫn c ủa nhà s ản xu ất, - Với m ẫu tách chi ết s ử dụng kit: sau khi tách chi ết ADN ti ến hành định l ượng ADN bằng ph ươ ng pháp Realtime PCR theo Trio DNA Quantification Kits (Applied Biosystem, M ỹ) trên máy 7500 Real- Time PCR (Applied Biosystem, M ỹ). 2.2.3. Ph ươ ng pháp điện di gel Ch ạy điện di phát hi ện s ản ph ẩm PCR trên gel Polyacrylamide 6%. 2.2.4. Phươ ng pháp PCR - Phân tích 29 ch ỉ th ị Y-STR: theo b ộ kit PowerPlex® Y23 System (hãng Promega - Mỹ) và Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific –Mỹ), thành ph ần ph ản ứng PCR v ới hai bộ kit tuân theo đúng h ướng d ẫn c ủa nhà s ản xu ất. - Phân tích 10 ch ỉ th ị mini Y-STR: thi ết k ế cặp m ồi và t ối ưu chu trình ph ản ứng PCR 2.2.5. Ph ươ ng pháp điện di mao qu ản - Phân tích 29 ch ỉ th ị Y-STR t ừ 2 b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus theo h ướng d ẫn c ủa nhà s ản xu ất - Sản ph ẩm sau PCR được tr ộn v ới thang n ội chu ẩn và Hi-Di Formamide, được tra vào gi ếng trên đĩa 96 gi ếng, s ốc ở nhi ệt độ 95 oC, trong 3 phút. Sau đó chuy ển ngay l ập t ức vào đá l ạnh để bi ến tính 3 phút và cho vào h ệ th ống máy điện di mao qu ản 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems - Mỹ) để phân tích với ch ươ ng trình được cài đặt theo h ướng d ẫn c ủa nhà s ản xu ất - Dữ li ệu được phân tích b ằng ph ần m ềm GeneMapper® ID-X 1.3 (Applied Biosystems - Mỹ). 2.2.6. Ph ươ ng pháp gi ải trình t ự gen Theo ph ươ ng pháp gi ải trình t ự gen Sanger v ới các b ước chính: tinh s ạch s ản ph ẩm sau PCR, Th ực hi ện ph ản ứng PCR v ới BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit , tinh s ạch sau ch ạy Bigdye, phân tích trên h ệ th ống máy ABI 3500Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Thermo Scientific, M ỹ). 2.3. Phân tích và x ử lý s ố li ệu Tần s ố của t ừng alen trong các locus, t ần su ất c ủa t ừng haplotype, t ổng s ố alen và t ổng s ố haplotype trong các nghiên c ứu được xác định b ằng Excel 2013 và ph ần m ềm Arlequin 1.3. Độ đa d ạng v ề gen (gene diversity – GD) c ủa t ừng locus Y-STR được tính theo công th ức: GD = n*(1- Σ pi2)/(n-1). 2 Haplotype diversity (HD) theo công th ức: HD = n*(1- Σ pi th )/(n-1) Kh ả năng phân bi ệt (Discrimination capacity - DC) được tính theo công th ức: DC= h/n Trong đó n là s ố mẫu, pi là t ần s ố của các alen t ươ ng ứng, p th là t ần s ố các haplotype t ươ ng ứng, h là s ố haplotype khác nhau được quan sát th ấy trong qu ần th ể. 4
7. 5 Ngoài ra chúng tôi c ũng s ử dụng công c ụ online AMOVA trên webiste để tính toán kho ảng cách di truy ền qu ần th ể (Rst) và giá tr ị xác su ất k ết h ợp (P value) gi ữa qu ần th ể nghiên c ứu và các qu ần th ể lân c ận. CH ƯƠ NG 3. KẾT QU Ả VÀ TH ẢO LU ẬN 3.1. K ết qu ả tách chi ết ADN từ các m ẫu nghiên c ứu Trong nghiên c ứu này v ới nh ững m ẫu ng ười s ống có n ồng độ ADN cao bao g ồm: m ẫu máu, tóc, niêm m ạc mi ệng chúng tôi s ử dụng ph ươ ng pháp tách chi ết b ằng Chelex® 100 – là ph ươ ng pháp đơ n gi ản, nhanh và có hi ệu qu ả cao. Ph ươ ng pháp tách b ằng h ạt chelex có ưu điểm là ng ăn ch ặn s ự phân h ủy ADN từ các enzym phân h ủy (DNase) và t ừ các ch ất gây nhi ễm ti ềm ẩn nh ư Mg2+ có th ể ức ch ế các phân tích sau. Tuy nhiên ph ươ ng pháp có h ạn ch ế là các b ước gia nhi ệt làm bi ến tính chu ỗi xo ắn kép và k ết qu ả là ADN sợi đơ n kém ổn định h ơn trong quá trình b ảo qu ản, n ồng độ ADN thu được sau tách chi ết không cao và không lo ại b ỏ được hoàn toàn các ch ất gây nhi ễm ho ặc ức ch ế ph ản ứng PCR nên phù h ợp v ới phân tích s ử dụng các kit th ươ ng m ại có độ nh ạy l ớn. Mẫu sau tách chi ết được định l ượng b ằng ph ươ ng pháp đo độ hấp th ụ trên máy Quantus Fluorometer (hãng Promega - Mỹ). Đây là ph ươ ng pháp đo d ựa trên tín hi ệu hu ỳnh quang phát ra, có độ nh ạy và độ chính xác cao h ơn so v ới ph ươ ng pháp đo OD truy ền th ống. Giá tr ị trung bình đo được là 2,70 ng/µl đến 10,05 ng/µl. Các m ẫu ADN tổng s ố này đều đạt tiêu chuẩn v ề số lượng và ch ất l ượng để sử dụng làm ADN đầu vào cho nghiên c ứu 29 ch ỉ th ị Y-STR s ử dụng b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus Với các m ẫu có ch ất l ượng kém, m ẫu đã b ị phân hu ỷ nhi ều nh ư m ẫu x ươ ng hài c ốt, m ẫu giám định án n ồng độ ADN thu được sau tách chi ết khá th ấp nên khó áp d ụng ph ươ ng pháp điện di gel để ki ểm tra. Thay vào đó chúng tôi s ử dụng ph ươ ng pháp định l ượng b ằng Trio DNA Quantification Kits (hãng Thermo Fisher Scientific – Mỹ) trên h ệ th ống máy Real time PCR. Bảng 3.1. Kết qu ả realtime PCR c ủa m ẫu x ươ ng, r ăng ký hi ệu R1-R5. T.Large autosomal: ADN kích th ước l ớn, T.Small autosomal: ADN kích th ước nh ỏ, T.Y: hàm lượng ADN trên NST Y. Ký hi ệu ADN đích Nồng độ ADN Ch ỉ số phân h ủy T.Large Autosomal 0.0572 R1 T.Small Autosomal 0.0787 1.376 T.Y 0.0721 T.Large Autosomal 0.0542 R2 T.Small Autosomal 0.1028 1.897 T.Y 0.0974 T.Large Autosomal 0.0124 R3 T.Small Autosomal 0.0202 1.633 T.Y 0.0196 T.Large Autosomal 0.0544 R4 T.Small Autosomal 0.0947 1.740 T.Y 0.0575 T.Large Autosomal 0.0665 R5 T.Small Autosomal 0.1007 1.513 T.Y 0.0975 5
8. 6 Kết qu ả Realtime PCR c ủa m ẫu x ươ ng, r ăng hài c ốt ký hi ệu R1-R5 minh h ọa cho th ấy hàm l ượng ADN kích th ước l ớn (T. Large autosomal) là r ất ít trong khi hàm l ượng ADN kích th ước nh ỏ (T. Small autsomal) l ại cao h ơn. Ch ỉ số phân hu ỷ (DI-Degradation Index) được tính b ằng t ỷ lệ gi ữa hàm l ượng ADN kích th ước nh ỏ/ ADN kích th ước l ớn là >1 ch ứng t ỏ mẫu hài c ốt có ADN bị phân huỷ. Nh ững m ẫu nh ư trên sẽ được x ếp vào nhóm m ẫu dùng trong nghiên c ứu đánh giá hi ệu qu ả phân tích Y-STR trên các m ẫu đã phân hu ỷ nhi ều. 3.2. Kết qu ả nghiên c ứu 29 ch ỉ th ị Y-STR t ừ 2 b ộ kit PowerPlex® Y23 System và Yfiler Plus 3.2.1. L ựa ch ọn các ch ỉ th ị Y-STR dùng trong nghiên c ứu Tính đến nay có kho ảng 400 marker Y-STR riêng r ẽ được nghiên c ứu rõ v ề cấu trúc và v ị trí trên NST. Tuy nhiên để được l ựa ch ọn thành locus có ti ềm n ăng ứng d ụng trong giám định ADN cần đáp ứng một s ố yêu c ầu nh ư: có độ đa hình cao, s ố alen t ươ ng đối l ớn, c ấu trúc l ặp không quá ph ức t ạp, đã được nghiên c ứu rõ v ề trình t ự gen, ph ươ ng pháp phân tích đơ n gi ản, có độ chính xác khi đọc k ết qu ả. D ựa trên các tiêu chí đó trong đề tài này chúng tôi l ựa ch ọn 29 locus Y-STR để kh ảo sát trong qu ần th ể nam gi ới ng ười Kinh, Vi ệt Nam s ử dụng hai b ộ kit Y-STR th ươ ng m ại ph ổ bi ến hi ện nay là b ộ PowerPlex®Y23 System (hãng Promega, g ọi t ắt là PowerPlex® Y23 System) và b ộ Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (hãng Thermo Fisher Scientific, g ọi t ắt là YPlus). 3.2.2. Xây d ựng h ồ sơ Y-STR Dựa theo h ướng d ẫn c ủa nhà cung c ấp chúng tôi đã thu được d ữ li ệu Y-STR t ừ 400 mẫu nghiên cứu đáp ứng các yêu c ầu v ề hồ sơ Y-STR hoàn ch ỉnh. Trong quá trình đọc phân tích d ữ li ệu c ần l ưu ý đến một s ố vấn đề hay g ặp ph ải để tránh đọc sai các đỉnh (peak) hay nh ận nh ầm đỉnh gi ả. Nh ững tr ường h ợp không đáp ứng đủ yêu c ầu nh ư đỉnh th ấp, m ẫu b ị nhi ễm trong quá trình thao tác (peak lên nhi ều h ơn 2 ở các locus thông th ường và nhi ều h ơn 3 ở hai locus DYS385ab và DYF387S1ab) s ẽ không đư a vào d ữ li ệu th ống kê chung. 3.2.3. B ảng kh ảo sát t ần su ất 29 locus Y-STR thu ộc b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus Tần su ất c ủa t ừng alen trong các locus Y-STR được th ống kê và tính toán trên ph ần m ềm Arlequin 1.3 để lập thành b ảng t ần su ất phân bố các alen c ủa t ừng locus Y-STR. B ảng d ữ li ệu t ần su ất alen c ủa t ừng locus c ũng được so sánh v ới d ữ li ệu chung đã được t ập h ợp t ừ số li ệu được công b ố trên trang web YHRD (www.yhrd.org) để th ấy được s ự tươ ng đồng c ũng nh ư sai khác v ề tần su ất phân b ố alen của 29 locus Y- STR trong nghiên c ứu. V ới m ỗi locus alen có t ần su ất phân b ố lớn nh ất được in đậm trong b ảng th ống kê. Nh ận xét: Nh ư v ậy t ừ vi ệc l ập h ồ sơ Y-STR c ủa 400 m ẫu nghiên c ứu v ới 2 b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus chúng tôi đã l ập được b ảng phân b ố tần su ất alen riêng c ủa 29 locus Y-STR. Kết qu ả so sánh cho th ấy có 16/29 locus có s ự phân b ố tần su ất alen t ươ ng đối gi ống v ới d ữ li ệu chung trên YHRD. Ng ược l ại có 13/29 locus có s ự phân b ố khác so v ới d ữ li ệu chung. Ngoài ra th ống kê c ũng cho th ấy có 41 alen hi ếm/ 29 locus. Điều này cho th ấy s ự sai khác trong c ấu trúc di truy ền c ủa qu ần th ể ng ười Kinh, Vi ệt Nam khi so sánh v ới các qu ần th ể khác. 6
9. 7 Bảng 3.2 : T ần su ất phân b ố 29 locus Y-STR thu ộc hai b ộ kit PowerPlex® Y23 System (PPY23) và YPlus DYS576 DYS389 I DYS448 DYS389 II DYS19 Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus 14 0.000 0.005 11 0.085 0.085 16 0.010 25 0.000 0.005 12 0.005 15 0.030 0.015 12 0.310 0.350 17 0.010 0.045 27 0.050 0.095 13 0.045 0.015 16 0.080 0.060 13 0.385 0.385 18 0.425 0.530 28 0.295 0.260 14 0.120 0.135 17 0.160 0.185 14 0.215 0.180 18.2 0.010 29 0.355 0.340 15 0.415 0.450 18 0.335 0.375 15 0.005 19 0.235 0.215 30 0.225 0.230 16 0.355 0.330 19 0.265 0.265 19.2 0.005 31 0.060 0.055 17 0.065 0.065 20 0.110 0.080 20 0.180 0.155 32 0.015 0.010 21 0.015 0.015 21 0.115 0.055 33 0.005 22 0.005 22 0.010 DYS391 DYS481 DYS549 DYS533 DYS438 sAlen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus 6 0.020 19 0.005 10 0.005 9 0.005 8 0.005 0.005 8 0.005 21 0.020 0.020 11 0.175 10 0.340 0.390 9 0.005 0.005 9 0.010 0.025 22 0.085 0.130 12 0.560 11 0.445 0.435 10 0.840 0.825 10 0.630 0.615 23 0.330 0.405 13 0.235 12 0.190 0.165 11 0.120 0.145 11 0.325 0.330 24 0.295 0.170 14 0.015 13 0.015 0.010 12 0.030 0.015 12 0.015 0.025 25 0.140 0.115 15 0.010 14 0.005 14 0.005 26 0.095 0.105 27 0.030 0.035 28 0.005 0.015 DYS437 DYS570 DYS635 DYS390 DYS439 Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus 12 0.000 0.005 14 0.000 0.025 18 0.005 0.005 22 0.025 0.035 10 0.035 0.025 13 0.005 0.000 15 0.040 0.045 19 0.050 0.030 23 0.255 0.180 11 0.255 0.260 14 0.730 0.730 16 0.330 0.310 20 0.130 0.110 24 0.360 0.385 12 0.530 0.520 15 0.255 0.250 17 0.230 0.175 21 0.365 0.405 25 0.305 0.365 13 0.160 0.160 16 0.010 0.015 18 0.135 0.135 22 0.195 0.205 26 0.055 0.035 14 0.015 0.030 19 0.145 0.140 23 0.190 0.195 15 0.005 0.005 20 0.075 0.120 24 0.050 0.040 21 0.025 0.030 25 0.015 0.010 22 0.015 0.010 23 0.005 0.010 DYS449 DYS518 DYS393 DYS458 DYS627 Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus 23 0.005 32 0.005 10 0.000 0.005 12 0.010 13 0.005 25 0.040 33 0.005 11 0.000 0.025 13 0.005 0.005 14 26 0.160 34 0.015 12 0.375 0.310 14 0.025 0.015 15 27 0.080 35 0.060 13 0.180 0.165 15 0.120 0.135 16 0.005 28 0.090 36 0.120 14 0.400 0.465 16 0.170 0.190 17 0.005 29 0.105 37 0.120 15 0.045 0.030 17 0.195 0.200 18 0.065 30 0.095 38 0.095 18 0.310 0.295 19 0.080 31 0.145 39 0.105 19 0.140 0.085 20 0.230 32 0.125 40 0.150 20 0.025 0.045 21 0.230 33 0.050 41 0.145 21 0.015 22 0.235 34 0.040 42 0.105 22 0.010 0.000 23 0.100 35 0.040 43 0.065 23 0.005 24 0.045 36 0.025 44 0.005 45 0.005 DYS456 YGATAH4 DYS643 DYS460 DYS392 Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus 12 0.005 10 0.130 0.125 8 0.015 9 0.110 10 0.010 13 0.090 0.060 11 0.365 0.425 9 0.075 10 0.645 11 0.100 0.045 14 0.180 0.165 12 0.465 0.425 10 0.190 11 0.190 12 0.035 0.030 15 0.525 0.570 13 0.040 0.025 11 0.290 12 0.050 13 0.655 0.700 16 0.160 0.155 12 0.350 13 0.005 14 0.200 0.205 17 0.025 0.040 13 0.080 15 0.010 0.010 18 0.020 0.005 7
10. 8 Bảng 3.3 . T ần su ất phân b ố alen locus DYS385a/b và DYF387S1 DYS385a/b DYF387S1 Alen PPY23 YPlus Alen PPY23 YPlus Alen YPlus 9, 17 0.005 13,20 0.040 0.035 34,34 0.010 11,11 0.015 0.005 13,21 0.005 0.010 34,36 0.005 11,12 0.015 13,22 0.010 0.005 34,37 0.005 11,13 0.005 14,14 0.005 34,40 0.005 11,14 0.005 0.005 14,15 0.010 35,36 0.005 11,15 0.005 14,16 0.005 0.015 35,37 0.010 11,17 0.005 0.005 14,17 0.005 35,38 0.045 11,18 0.035 0.020 14,18 0.025 0.010 35,39 0.015 11,19 0.010 14,19 0.020 0.025 35,40 0.010 11,20 0.010 0.005 14,20 0.010 36,36 0.040 12,12 0.025 0.010 14,21 0.015 36,37 0.050 12,12.3 0.005 15,15 0.010 36,38 0.100 12,13 0.005 0.010 15,16 0.005 0.010 36,39 0.070 12,14 0.005 0.015 15,17 0.010 36,40 0.025 12,15 0.005 15,18 0.030 0.005 36,41 0.015 12,16 0.015 0.015 15,19 0.020 0.060 37,37 0.090 12,17 0.020 0.020 15,20 0.015 0.025 37,38 0.140 12,18 0.050 0.030 15,21 0.015 0.015 37,39 0.080 12,19 0.035 0.035 15,22 0.005 37,40 0.015 12,20 0.040 0.055 15,23 0.005 37,41 0.010 12,21 0.010 16,17 0.005 38,38 0.095 13,13 16.000 0.080 16,18 0.005 38,39 0.040 13,14 3.000 0.015 16,19 0.005 0.015 38,40 0.030 13,15 0.015 16,20 0.020 0.015 39,39 0.040 13,16 0.005 0.015 16,21 0.015 0.005 39,40 0.020 13,17 0.050 0.045 17,20 0.010 39,41 0.005 13,18 0.150 0.185 18,19 0.005 40,40 0.020 13,19 0.120 0.105 40,41 0.005 Bảng t ần su ất phân b ố Y-STR được xây d ựng trong nghiên c ứu này là b ảng có s ố lượng m ẫu nghiên cứu cùng nh ư s ố locus nhi ều nh ất được kh ảo sát trong qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam cho đến nay v ới s ố lượng mẫu và ph ươ ng pháp nghiên c ứu đạt độ tin c ậy cao. Các công b ố tr ước đây đối v ới qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam ch ủ yếu được th ực hi ện v ới 13-17 Y-STR trên s ố lượng m ẫu t ươ ng đối nh ỏ dưới 200 m ẫu. Vi ệc xây dựng b ảng t ần su ất c ủa nh ững locus Y-STR c ũng m ới là điều c ần thi ết, đáp ứng nhu c ầu tính toán ch ỉ số hình s ự liên quan đến nam gi ới trong qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam. Trên d ữ li ệu chung YHRD có th ể th ấy s ố lượng haplotype được công b ố sử dụng 2 b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus t ừ các nghiên c ứu v ới các qu ần th ể trên toàn th ế gi ới là khá l ớn. Ng ược l ại v ới qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam tr ước nghiên c ứu này s ố lượng haplotype được công b ố còn r ất h ạn ch ế ch ỉ với 45 haplotype t ừ bộ PowerPlex® Y23 System và 47 halotype v ới b ộ YPlus được đóng góp thông m ột s ố nghiên c ứu nh ỏ lẻ trên qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam. Với nghiên c ứu này chúng tôi đã đóng góp thêm 200 haptype s ử dụng b ộ PowerPlex® Y23 System vào d ữ li ệu chung YHRD v ới mã s ố truy c ập là YA004576 nâng t ổng s ố hapotype trên d ữ li ệu YHRD ở qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam lên 245 v ới b ộ PowerPlex® Y23 System. 8
11. 9 3.2 4. Đánh giá đặc điểm các alen thu ộc 29 ch ỉ th ị Y-STR Với t ừng locus s ố lượng alen dao động t ừ 4 đến 15 alen v ới trung bình là 7 alen / 1 locus. Trong đó với b ộ kit PowerPlex® Y23 System có t ổng s ố 144 alen, b ộ kit YPlus là 183 alen. V ới riêng t ổ hợp g ồm 2 alen, DYS385a/b có 55 t ổ hợp alen khác nhau, DYF387S1a/b có 28 t ổ hợp alen khác nhau được quan sát th ấy. V ới c ả hai b ộ kit nói chung, DYS458, DYS570 là các locus có s ố lượng alen nhi ều nh ất v ới kho ảng 10 alen cho m ỗi locus. Ng ược l ại locus DYS437 ti ếp theo là DYS438, DYS393, DYS390 có s ố alen ít nh ất (4-5 alen/locus). Riêng b ộ kit YPlus có DYS518, DYS449 là các locus m ới được b ổ sung thêm so v ới b ộ PowerPlex® Y23 System đồng th ời c ũng là các locus có s ố lượng alen nhi ều nh ất (DYS518: 14 alen, DYS449: 13 alen). Tổng s ố alen quan sát th ấy trong nghiên c ứu là 209 alen, nhi ều h ơn đáng k ể so v ới các công b ố tr ước đây v ới qu ần th ể ngu ời Vi ệt Nam. Trong nghiên c ứu kh ảo sát trên 205 nam gi ới s ử dụng b ộ kit AmpFLSTR™ Yfiler™ PCR Amplification Kit g ồm 17 locus c ủa tác gi ả Toàn T.T ghi nh ận 99 alen. Số alen trong nghiên c ứu c ũng ở mức t ươ ng đươ ng khi so sánh v ới qu ần th ể khác trên th ế gi ới. Ví d ụ nh ư trong nghiên c ứu kh ảo sát trên 581 nam gi ới dân t ộc Hán thu ộc t ỉnh Thi ểm Tây – Trung Qu ốc s ử dụng b ộ kit PPY23 quan sát th ấy 237 alen. Nghiên c ứu kh ảo sát trên 436 m ẫu ng ười nam gi ới thu ộc các ti ểu V ươ ng qu ốc Ả rập Th ống nh ất (UAE) s ử dụng b ộ YPlus cho th ấy có 202 alen khác nhau. Trong nghiên c ứu này trên tất c ả locus đều không phát hi ện th ấy tr ường h ợp n ằm ngoài thang alen (off ladder), phát hi ện th ấy 02 bi ến th ể alen t ại locus DYS448 (alen 18.2, 19.2), 1 bi ến th ể tại locus DYS385b (alen 12.3). Trong quá trình kh ảo sát c ũng quan sát th ấy 2 tr ường h ợp m ất alen (còn g ọi là null alen). V ới tr ường h ợp đầu tiên phát hi ện m ất 18/23 locus Y-STR khi phân tích v ới b ộ kit PowerPlex® Y23 System. Tr ường h ợp còn l ại là có null alen t ại 4 locus DYS481, DYS576, DYS570, DYS458. Phân tích xác nh ận l ại b ằng b ộ kit YPlus c ũng cho k ết qu ả tươ ng t ự. D ựa vào vi ệc xác định v ị trí các locus b ị mất trên bản đồ NST Y nh ận th ấy đây là tr ường h ợp m ất đoạn l ớn trên c ả cánh dài và cánh ng ắn c ủa NST Y. 16 14 12 10 8 6 4 2 0 DYS19 DYS448 DYS391 DYS481 DYS549 DYS533 DYS438 DYS437 DYS570 DYS635 DYS390 DYS439 DYS392 DYS643 DYS393 DYS458 DYS385 DYS456 DYS627 DYS460 DYS518 DYS449 DYS576 DYS389 I DYS389 DYS389 II DYS389 Số alen bộ Y23 Số alen bộ Y27 YGATAH4 DYF387S1 Hình 3.1: S ố alen c ủa 29 locus Y-STR d ựa trên 2 b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus 9
12. 10 3.2.5. Độ đa hình của 29 ch ỉ th ị Y-STR Từ tần su ất phân b ố các alen chúng tôi đã tính toán được độ đa hình hay là độ dạng gen (GD - gene diversity) c ủa t ừng locus Y-STR trong nghiên c ứu. Kết qu ả cho th ấy hai locus v ới t ổ hợp 2 alen là DYS385a/b và DYS387S1a/b là các locus có độ da d ạng di truy ền cao nh ất (GD l ần l ượt 0.941, 0.934). V ới các locus đơ n alencó chung ở hai b ộ kit DYS458, DYS570 được coi là các locus có độ đa hình cao nh ất (GD trung bình l ần l ượt là 0.809, 0.808) đồng th ời c ũng là các locus có s ố alen nhi ều nh ất (9 - 10 alen). Ng ược locus DYS438 là locus có độ đa hình th ấp nh ất (GD kho ảng 0.28) v ới ch ỉ 4 - 5 alen phát hi ện được trong qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam, ti ếp theo là DYS437 (GD: 0.490), DYS392 (GD: 0.495), DYS391 (GD:0.507). Đây được coi là các locus có độ đa hình th ấp nh ất nh ỏ hơn 0.5. Các nghiên c ứu tr ước đây v ề qu ần th ể ng ười Kinh Vi ệt Nam c ũng cho th ấy DYS437, DYS438 c ũng là các locus có giá tr ị GD th ấp nh ất. K ết qu ả này c ũng khá t ươ ng đồng v ới phân tích toàn c ầu v ề 23 locus Y-STR cho th ấy các locus DYS391, DYS437 và DYS438 có giá tr ị GD th ấp h ơn so v ới các locus Y-STR khác trong các qu ần th ể ng ười châu Ád ựa theo nghiên c ứu kh ảo sát t ần su ất 23 Y-STR t ừ 129 qu ần th ể thu ộc 51 qu ốc gia c ủa Josephine Purps và cs. K ết qu ả so sánh độ đa hình 23 locus Y-STR v ới m ột s ố nước khác trong khu v ực c ũng cho th ấy s ự tươ ng đồng. Độ đa hình c ủa 6 locus m ới trong b ộ YPlus được so sánh với th ống kê trên qu ần th ể ng ười châu Á t ại M ỹ do nhà s ản xu ất cung c ấp c ũng cho th ấy t ươ ng quan trong giá tr ị. Tuy nhiên độ đa hình c ũng có s ự chênh l ệch đáng k ể so v ới d ữ li ệu chung ở 4 locus là DYS392, DYS391, DYS438 và DYS460. Trong đó locus DYS392, DYS438, DYS460 trong qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam có độ đa hình th ấp h ơn khá nhi ều so v ới các n ước cùng khu v ực, ng ược l ại DYS391 l ại có độ đa hình cao h ơn. Nh ững khác bi ệt này ph ản ánh đặc tr ưng và s ự phân tách v ốn gen trong qu ần th ể ng ười Kinh, Vi ệt Nam so v ới các qu ần th ể khác. Bảng 3.4 . Độ đa d ạng gen c ủa 29 locus Y-STR trong nghiên c ứu và so sánh v ới giá tr ị trung bình c ủa qu ần th ể ng ười châu Á PPY23 YPlus Độ l ệch GD trung GD châu Độ l ệch STT Tên locus GD GD chu ẩn bình Á chu ẩn 1 DYS576 0.776 0.748 0.01 0.762 0.7996 0.02 2 DYS389 I 0.713 0.693 0.01 0.703 0.6564 0.02 3 DYS389 II 0.734 0.751 0.01 0.742 0.6585 0.04 4 DYS448 0.713 0.647 0.03 0.680 0.7650 0.04 5 DYS19 0.685 0.669 0.01 0.677 0.6920 0.01 6 DYS391 0.499 0.514 0.01 0.507 0.4136 0.05 7 DYS481 0.771 0.768 0.00 0.769 0.8416 0.04 8 DYS549 0.603 0.603 0.6425 0.02 9 DYS533 0.653 0.635 0.01 0.644 0.6265 0.01 10 DYS438 0.280 0.300 0.01 0.290 0.5707 0.14 11 DYS437 0.404 0.406 0.00 0.405 0.4891 0.04 10
13. 11 12 DYS570 0.795 0.821 0.01 0.808 0.8313 0.01 13 DYS635 0.774 0.745 0.01 0.760 0.7700 0.01 14 DYS390 0.712 0.687 0.01 0.700 0.7325 0.02 15 DYS439 0.630 0.638 0.00 0.634 0.6823 0.02 16 DYS392 0.522 0.467 0.03 0.495 0.7434 0.12 17 DYS643 0.749 0.749 0.7510 0.00 18 DYS393 0.668 0.662 0.00 0.665 0.6597 0.00 19 DYS458 0.806 0.813 0.00 0.809 0.8275 0.01 20 DYS385 0.947 0.936 0.01 0.941 0.9741 0.02 21 DYS456 0.661 0.622 0.02 0.641 0.6093 0.02 22 YGATAH4 0.635 0.626 0.00 0.630 0.6345 0.00 23 DYS627 0.820 0.820 0.8120 0.00 24 DYS460 0.536 0.536 0.6750 0.07 25 DYS518 0.893 0.893 0.8670 0.01 26 DYS449 0.900 0.900 0.8820 0.01 27 DYF387S1 0.934 0.934 0.9450 0.01 Kết qu ả sắp x ếp theo độ đa hình c ủa 29 locus Y-STR trong hình 3.2 cho th ấy số locus có độ đa hình từ 0.7-1 chi ếm t ỷ lệ nhi ều nh ất v ới 84.2% (bao g ồm 16/29 locus v ới 5 locus có giá tr ị GD> 0.9, 4 locus có GD nằm trong kho ảng 0.8-0.9, 7 locus GD trong kho ảng 0.7-0.8), 9 locus có GD trong kho ảng 0.5 – 0.6 chi ếm 31% và ch ỉ có 4 locus có GD ≤ 0.5. Qua đó cho th ấy h ầu h ết các locus trong nghiên c ứu đều có độ đa hình khá cao, có ti ềm n ăng l ớn trong vi ệc phân bi ệt các cá th ể nam gi ới trong qu ần th ể ng ười Kinh, Vi ệt Nam được kh ảo sát. 3.2.6. Độ đa d ạng haplotype (HD) và kh ả năng phân bi ệt Với riêng t ừng b ộ kit khi phân tích 200 m ẫu nghiên c ứu chúng tôi quan sát th ấy 200 haplotype khác nhau, ngh ĩa là m ỗi haplotype đều là duy nh ất trong qu ần th ể kh ảo sát. Do đó độ đa d ạng haplotype (haplotype diversity - HD) là 1.00. Kh ả năng phân bi ệt (discriminating capacity - DC) được tính là t ỷ số của s ố haplotype khác nhau được quan sát th ấy trong qu ần th ể/ t ổng s ố mẫu nghiên c ứu. Do các haplotype đều là duy nh ất nên kh ả năng phân bi ệt cá th ể là 100% v ới cá 2 b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus. Điều này ph ản ánh ti ềm n ăng cao c ủa 29 locus Y-STR trong vi ệc phân bi ệt các cá th ể nam không có liên quan huy ết th ống theo dòng cha. Kết qu ả này c ũng phù h ợp v ới nghiên c ứu c ủa Toan T.T khi kh ảo sát trên qu ần th ể ng ười Kinh, Vi ệt Nam v ới t ổ hợp 17 Y-STR trong b ộ Yfiler c ũng cho kh ả năng phân bi ệt 100%. Cũng trên qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam trong nghiên c ứu c ủa Koji Dewa kh ảo sát trên 119 m ẫu v ới t ổ hợp 13 Y-STR ch ỉ cho kh ả năng phân bi ệt ch ỉ 95%. Điều này m ột l ần n ữa cho th ấy vi ệc t ăng s ố lượng Y-STR phân tích s ẽ góp ph ần làm t ăng độ đa d ạng haplotype và kh ả năng phân bi ệt. 11
14. 12 Nghiên c ứu kh ảo sát v ới b ộ kit PowerPlex® Y23 System trên 129 qu ần th ể khác nhau trên th ế gi ới cũng cho th ấy các qu ần th ể châu Á có kh ả năng phân bi ệt cao nh ất (> 97%), ti ếp theo là Châu Âu và Châu Mỹ Latinh (DC kho ảng 96%) và cu ối cùng là Châu Phi (DC kho ảng 85%). 3.3. Nghiên c ứu m ột s ố chi thi mini Y-STR 3.3.1. L ựa ch ọn locus mini Y-STR Do yêu c ầu trong các b ộ kít th ươ ng m ại ph ải khu ếch đại đồng th ời nhi ều locus Y-STR khác nhau nên để phân bi ệt được trong quá trình điện di mao qu ản đòi h ỏi các locus ph ải có kích th ước khác nhau. Kết qu ả là m ột s ố locus Y-STR có kích th ước khá l ớn (>200 bp) r ất khó để phân tích thành công v ới các mẫu có ADN đã b ị phân h ủy, ADN bị đứt gãy nhi ều. Các mini Y-STR v ới đặc điểm là có kích th ước ng ắn dưới 200 bp phù h ợp v ới các lo ại m ẫu sinh h ọc đã phân hu ỷ có ADN bị đứt gãy nhi ều. Hi ện nay, t ại Vi ệt Nam s ố lượng các công trình nghiên c ứu v ề locus Y-STR còn r ất h ạn ch ế và c ũng ch ưa có nghiên c ứu v ề thi ết k ế các c ặp m ồi khu ếch đại locus mini Y-STR nh ằm ứng d ụng phân tích ADN cho các m ẫu sinh h ọc đã phân h ủy. Vì v ậy, để tạo điều ki ện thu ận l ợi cho công tác giám định ADN cũng nh ư giám định hài c ốt tại Vi ện Pháp y qu ốc gia đạt được k ết qu ả tốt bên c ạnh 29 locus Y-STR có trong 2 b ộ kit nêu trên chúng tôi th ử nghiên c ứu các locus Y-STR m ới có ti ềm n ăng ứng d ụng trong giám định ADN với qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam. Trong nghiên cứu này chúng tôi l ựa ch ọn các locus có độ đa hình cao trong qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam, ngoài ra còn có kích th ước l ớn trong các b ộ kit th ươ ng m ại và c ố gắng gi ảm t ối thi ểu kích th ước các locus Y-STR để đạt được t ỷ lệ phân tích thành công cao v ới các m ẫu đã bị phân h ủy. Trong s ố 29 ch ỉ th ị Y-STR thu ộc hai b ộ kit chúng tôi l ựa ch ọn các ch ỉ th ị có độ đa hình cao > 0.6, có kích th ước > 200 bp và có kh ả năng rút g ọn kích th ước vùng lõi l ặp. D ựa trên các tiêu chí đó chúng tôi đã l ựa ch ọn 5 ch ỉ th ị Y-STR là DYS481, DYS643, DYS533, DYS19, Y-GATA-H4. Đây đều là các ch ỉ th ị nằm trong b ộ kit PowerPlex® Y23 System. Bên c ạnh đó chúng tôi c ũng thi ết k ế mồi để khu ếch đại thêm 1 ch ỉ th ị DYS460 n ằm trong b ộ YPlus và 4 ch ỉ th ị mini Y-STR là: DYS505, DYS522, DYS508, DYS388 là nh ững locus ch ưa có trong kit th ươ ng m ại nh ưng theo m ột s ố nghiên c ứu đã được công b ố cho th ấy có độ đa hình cao, có ti ềm n ăng ứng dụng trong phân tích Y-STR 3.3.2. T ối ưu hoá điều ki ện ph ản ứng PCR Ph ản ứng PCR được kh ảo sát v ới 10 c ặp m ồi trong 10 ph ản ứng PCR riêng r ẽ. Nhi ệt độ gắn m ồi của t ừng locus dao động t ừ 56 – 58 oC. Chu trình ph ản ứng PCR được t ối ưu hóa v ới các điều ki ện bao gồm: n ồng độ mồi, nhi ệt độ gắn m ồi, th ời gian kéo dài chu ỗi. S ản ph ẩm sau PCR được ki ểm tra trên gel Polyacryamide 6%. Hình ảnh điện di cho th ấy các b ăng s ản ph ẩm PCR rõ nét, không có b ăng ph ụ và có kích th ước đúng nh ư các công b ố tr ước đó. Kích th ước các locus dao động t ừ 91-213bp. Điều này cho th ấy các c ặp m ồi được thi ết k ế có tính kh ả dụng cho vi ệc khu ếch đại các locus Y-STR mong mu ốn. 12
15. 13 Ph ản ứng PCR được kh ảo sát trong 10 ph ản ứng PCR riêng r ẽ. Chu trình ph ản ứng PCR được t ối ưu hóa v ới các điều ki ện bao g ồm: n ồng độ mồi, nhi ệt độ gắn m ồi, th ời gian kéo dài chu ỗi. S ản ph ẩm sau PCR được ki ểm tra trên gel Polyacryamide 6%. Hình 3.2: Ảnh điện di s ản ph ẩm sau PCR v ới 10 locus Y-STR trên gel Polyacrylamide 6% (S ử dụng thang chu ẩn ILS 500 (Promega – Mỹ)) Vi ệc th ực hi ện các ph ản ứng PCR đơ n l ẻ với cùng m ột m ẫu nghiên c ứu đòi h ỏi tiêu t ốn nhi ều hóa ch ất, th ời gian và công s ức. Ph ản ứng PCR đa m ồi được thi ết k ế dựa trên vi ệc tr ộn nhi ều c ặp m ồi vào trong cùng 1 ph ản ứng nh ằm khu ếch đại đồng th ời nhi ều locus Y-STR là c ải ti ến phù h ợp h ơn. Nguyên t ắc để lựa ch ọn các locus Y-STR khu ếch đại cùng nhau là các locus ph ải có nhi ệt độ gắn mồi t ươ ng đồng nhau, ng ược lại s ản ph ẩm PCR ph ải có kích th ước chênh l ệch nhau để đảm b ảo s ự phân tách trong quá trình điện di ki ểm tra. Trong nghiên c ứu này do các locus Y-STR đều có kích th ước trong kho ảng 100 - 200 bp, kích th ước chênh l ệch nhau không nhi ều nên s ố các locus trong ph ản ứng PCR đa m ồi không v ượt quá 4 locus. Chúng tôi đã t ối ưu n ồng độ mồi, nhi ệt độ gắn m ồi và khu ếch đại thành công 8 trong s ố 10 locus Y-STR thông qua 3 ph ản ứng PCR đa m ồi khác nhau. Ph ản ứng multiplex PCR v ới nhi ều c ặp m ồi cùng cũng là c ơ s ở để tạo nên các b ộ kit STR và Y-STR th ươ ng m ại hi ện nay có th ể phân tích lên t ới 27 locus thông qua m ột ph ản ứng PCR duy nh ất 13
16. 14 Hình 3. 3. Ảnh điện di trên gel polyacrylamide các ph ản ứng PCR đa m ồi 3.3.3. Gi ải trình t ự xác định c ấu trúc l ặp c ủa các locus Y-STR m ới Kết qu ả gi ải trình t ự trên máy ABI 3500, Pop7, Cappilarry 50 cm v ới ch ươ ng trình ch ạy c ủa hãng cho trình t ự có các đỉnh sóng rõ ràng. Vi ệc gi ải trình t ự cũng cho phép xác định rõ motif l ặp, s ố lần l ặp đặc tr ưng c ủa t ừng locus Y-STR. Ví d ụ locus DYS505 có c ấu trúc l ặp là TCCT v ới s ố lần l ặp là 15 hay chính là alen 15 (hình 3.4). Hình 3.4. K ết qu ả gi ải trình t ự locus DYS505 Kết qu ả gi ải trình t ự locus DYS505 cho th ấy kích th ước đoạn kho ảng h ơn 170 bp và c ấu trúc l ặp TCCT. Vi ệc gi ải trình t ự cũng cho phép xác định rõ motif l ặp, s ố lần l ặp đặc tr ưng c ủa t ừng locus Y-STR. Ví d ụ locus DYS505 có c ấu trúc l ặp là TCCT v ới s ố lần l ặp là 15 hay chính là alen 15 (hình 3.4). Đây c ũng là c ơ s ở để xây d ựng thang alen cho các locus m ới ch ưa có trong các b ộ kit th ươ ng m ại. Vi ệc đếm s ố lần lặp c ủa c ấu trúc lõi b ằng ph ươ ng pháp gi ải trình t ự cũng cho k ết qu ả trùng kh ớp v ới vi ệc phân tích b ằng kit th ươ ng m ại nh ư minh h ọa locus DYS643 (Hình 3.5). Trong nghiên c ứu này v ới các m ẫu đã được xác định rõ alen b ằng chúng tôi đã xây d ựng thang alen c ủa ch ỉ th ị DYS643 ( đã có trong b ộ PowerPlex® Y23 System) d ựa vào ph ươ ng pháp mini Y-STR. Thang alen này s ẽ làm c ơ s ở để xác định s ố alen chính xác mà 14
17. 15 không c ần ph ải gi ải trình t ự lại trong các phân tích sau này đồng th ời c ũng là c ơ s ở để phân bi ệt s ự sai khác alen gi ữa các m ẫu. Hình 3.5 . K ết qu ả tạo thang chu ẩn mini Y-STR v ới ch ỉ th ị DYS643 A. K ết qu ả GTT v ới s ố lần l ặp CTTTT là 11, B. K ết qu ả phân tích s ử dụng b ộ PowerPlex® Y23 System với s ố alen là 11, C: Thang chu ẩn ch ỉ th ị DYS643 v ới 4 alen 10, 11,12, 13 3.3.4. K ết qu ả phân tích 10 mini Y-STR trên m ẫu phân h ủy Dựa vào ph ươ ng pháp PCR đa m ồi v ới 10 c ặp m ồi nêu trên chúng tôi đã ứng d ụng trong vi ệc phân tích 50 m ẫu nghiên c ứu đã b ị phân h ủy là nh ững m ẫu x ươ ng và r ăng hài c ốt li ệt s ỹ thu th ập t ừ các ngh ĩa trang. Với các m ẫu r ăng, x ươ ng đã b ị phân h ủy t ỷ lệ khu ếch đại thành công c ủa 10 mini Y-STR dao động từ 44 % đến 82%. C ụ th ể: có 2 locus DYS533 và DYS481 đạt t ỷ lệ thành công cao nh ất (l ần l ượt là 80%, 76.7%) v ới kích th ước locus ch ỉ kho ảng 100 - 150 bp. Ti ếp theo là các locus DYS388, DYS508, DYS460, YGATA-H4 đạt t ỷ lệ thành công t ừ 66.7 – 73.3% v ới kho ảng kích th ước khu ếch đại dao động t ừ 91 – 141 bp. Hai locus DYS522, DYS505 v ới kích th ước kho ảng 112 – 176 bp ch ỉ đạt t ỷ lệ thành công 53,3% và 56,7%. Riêng hai locus có kích th ước l ớn là DYS19 (177-213 bp) và DYS643 (121 – 166 bp) đạt t ỷ lệ khu ếch đại khá th ấp, l ần l ượt là 43.3 % và 50%. Bảng 3. 5. Bảng th ống kê t ỷ lệ khu ếch đại thành công 10 locus mini Y-STR trên 30 m ẫu đã b ị phân h ủy Kích th ước trong Kích th ước trong Kích th ước dùng Tỷ l ệ khu ếch đạ i Locus PPY23 YPlus mini Y-STR thành công DYS533 245-285 338-379 107-127 80.0% DYS19 312-352 184-224 177-213 43.3% DYS481 139-184 207-252 119-149 76.7% DYS643 368-423 121-166 50.0% 15
18. 16 Y-GATA-H4 374-414 236-264 121-141 70.0% DYS460 79-109 101-121 60.0% DYS505 164-176 56.7% DYS508 105–129 73.3% DYS388 91-106 66.7% DYS522 112–132 53.3% Điều này có th ể được lý gi ải do locus có kích th ước càng l ớn (ví d ụ locus DYS19 ~ 200bp) thì t ỷ lệ khu ếch đại thành công càng th ấp. Đặc bi ệt là v ới các m ẫu hài c ốt có ADN đã b ị phân h ủy, đứt gãy nhi ều. Ngoài ra m ột y ếu t ố khác ảnh h ưởng đến hi ệu su ất PCR là ch ất l ượng m ẫu nghiên c ứu. Trong nghiên c ứu v ới nh ững m ẫu hài c ốt lâu n ăm đã phân h ủy n ặng (ch ỉ số phân h ủy ở mức cao), ADN bị đứt gãy nhi ều thì vi ệc khu ếch đại h ết các locus Y-STR c ũng g ặp khó kh ăn. Đặc bi ệt trong điều ki ện khí h ậu Vi ệt Nam nóng ẩm, nhi ều lo ại vi sinh v ật trong lòng đất ảnh h ưởng l ớn đến ch ất l ượng m ẫu x ươ ng. D ựa theo kết qu ả nghiên c ứu có th ể th ấy có kho ảng ít nh ất 9 m ẫu phân tích không thành công khi s ử dụng mini STR. Có th ể th ấy vi ệc ứng d ụng mini Y-STR gi ải quy ết trong nhi ều tình hu ống đặc bi ệt là trong công tác giám định m ẫu phân h ủy. 3.4. Hi ệu qu ả của các ch ỉ th ị Y-STR trong xét nghi ệm ADN 3.4.1. Hi ệu qu ả trong phân tích m ẫu đã b ị phân hu ỷ Sau khi nghiên c ứu thành công k ỹ thu ật khu ếch đại các mini Y-STR v ới các c ặp m ồi t ươ ng ứng, chúng tôi đã th ử ứng d ụng vào m ột s ố tr ường h ợp giám định c ụ th ể tại t ại Khoa Y - Sinh h ọc, Vi ện Pháp y qu ốc gia. 3.4.1.1. Trong công tác giám định án Hi ện nay m ỗi n ăm t ại Khoa Y sinh h ọc đang th ực hi ện nhi ệm v ụ giám định v ụ án t ừ quy ết định tr ưng c ầu giám định c ủa c ơ quan công an. R ất nhi ều m ẫu thu th ập t ại hi ện tr ường v ụ án được thu sau th ời điểm x ảy ra v ụ án m ột th ời gian khi ến ch ất l ượng ADN trên m ẫu v ật không còn nguyên v ẹn ho ặc l ượng ADN thu th ập trên m ẫu r ất ít (m ẫu ở dạng vi v ết). Điều này gây khó kh ăn r ất nhi ều cho công tác giám định và đư a ra k ết lu ận. V ới hi ệu qu ả trong nghiên c ứu mini Y-STR chúng tôi đã ứng d ụng trong th ực t ế giám định và thu được các k ết qu ả nh ất định có th ể minh h ọa qua tr ường h ợp c ụ th ể. Nh ững tr ường h ợp này khi xét nghi ệm so sánh gi ữa h ồ sơ m ẫu thu t ại hi ện tr ưởng ho ặc m ẫu thu c ủa n ạn nhân có h ồ sơ Y-STR b ằng 2 bộ PowerPlex® Y23 System và YPlus không lên đủ ở tất c ả các locus, đặc bi ệt là các locus có kích th ước lớn nên không đủ cơ s ở để so sánh v ới m ẫu nghi ph ạm. Khi đó vi ệc phân tích thêm các mini Y-STR s ẽ giúp bổ sung d ữ li ệu vào h ồ sơ Y-STR, cho phép đư a ra k ết lu ận m ẫu thu t ại hi ện tr ường (n ạn nhân) là trùng/khác với m ẫu thu t ừ nghi ph ạm. Đây là bi ện pháp có hi ệu qu ả trong m ột s ố vụ án đã được giám định. 3.4.1.2. Trong công tác giám định danh tính li ệt s ỹ Trong công tác giám định danh tính hài c ốt li ệt s ỹ; hài c ốt – là nh ững m ẫu có ADN bị phân hu ỷ, đứt gãy nhi ều. Thông th ường để th ực hi ện giám định hài c ốt s ẽ dựa vào phân tích và so sánh trình t ự các 16
19. 17 vùng siêu bi ến HV1, HV2 trên ADN ty th ể nh ằm xác định m ối quan h ệ huy ết th ống theo dòng m ẹ. Tuy nhiên trong m ột s ố tr ường h ợp khi phân tích vùng HV1, HV2 trên ADN ty th ể cho th ấy có s ự sai khác r ất nh ỏ tại 1-2 v ị trí. S ự sai khác này nh ất có th ể do s ự khác nhau v ề huy ết th ống gi ữa 2 cá th ể ho ặc do đột bi ến ty th ể, s ự amin hoá do m ẫu ti ếp xúc lâu v ới điều ki ện môi tr ường không thu ận l ợi. V ới nh ững tr ường h ợp này s ẽ không đủ cơ s ở để kết lu ận m ối quan h ệ huy ết th ống theo dòng m ẹ. Ho ặc có tr ường h ợp ch ỉ có m ẫu so sánh theo dòng cha (con trai, cháu trai ) thì không th ể áp d ụng ph ươ ng pháp phân tích ADN ty th ể. Khi đó vi ệc phân tích thêm mini Y-STR s ẽ cung c ấp d ữ li ệu b ổ sung có giá tr ị quan tr ọng trong vi ệc đư a ra k ết lu ận cu ối cùng. 3.4.1.3. Hi ệu qu ả của 2 b ộ kit trong phân tích m ẫu đã phân h ủy Bên c ạnh các mini Y-STR hai b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus c ũng đều g ồm m ột s ố các alen v ừa có kích th ước nh ỏ vừa có độ đa d ạng gen s ẽ là các locus gen lý t ưởng cho vi ệc phân tích b ổ sung trong các tr ường h ợp giám định ADN với m ẫu đã b ị phân h ủy nhi ều, ADN đã b ị đứt gãy thành các đoạn nh ỏ nh ư trong m ẫu x ươ ng hài c ốt, m ẫu sau th ảm h ọa, thiên tai Để đánh giá ti ềm năng phân tích v ới m ẫu đã b ị phân hu ỷ chúng tôi l ọc riêng d ữ li ệu t ập h ợp các Y-STR có kích th ước < 220 bp thu ộc 2 b ộ kit khi phân tích v ới 400 m ẫu nghiên c ứu và tính toán các ch ỉ số di truy ền liên quan. Bảng 3.6. So sánh các ch ỉ số di truy ền thu được t ừ tập h ợp các marker Y-STR có kích th ước < 220 bp trong 2 b ộ PowerPlex® Y23 System (PPY23) và YPlus Số haplotype Bộ haplotype Bộ haplotype Ch ỉ xu ất hi ện ở 1 cá th ể 188 178 Xu ất hi ện ở 2 cá th ể 3 4 Xu ất hi ện ở 3 cá th ể 2 1 Xu ất hi ện ở 4 cá th ể 0 1 Xu ất hi ện ở 5 cá th ể 0 0 Xu ất hi ện ở 6 cá th ể 0 0 Xu ất hi ện ở 7 cá th ể 0 1 Xu ất hi ện ở 8 cá th ể 0 0 Xu ất hi ện ở 9 cá th ể 0 0 Xu ất hi ện ở 10 cá th ể 0 0 Tổng s ố locus 8 10 Tổng s ố haplotype quan sát 193 185 HD 0.99954 0.99829 DC 97% 93% Bộ PowerPlex® Y23 System gồm 8 locus có kích th ước < 220 bp (DYS576, DYS389I, DYS391, DYS481, DYS570, DYS635, DYS393 và DYS458). B ộ YPlus g ồm 10 locus có kích th ước < 220 bp (DYS576, DYS389I, DYS458, DYS456, DYS390, DYS570, DYS437, DYS393, DYS439 và DYS460). Kết qu ả trong B ảng 3.5 cho th ấy với tập h ợp Y-STR thu ộc bộ PowerPlex® Y23 System xu ất hi ện haplotype gi ống nhau ở 2, 3 cá th ể trong khi b ộ YPlus có haplotype gi ống nhau ở 2,3,4 và 7 cá th ể. S ố haplotype quan sát được trong b ộ PowerPlex® Y23 System và YPlus l ần l ượt là 193, 185 haplotypes (trên t ổng s ố 200 m ẫu 17
20. 18 phân tích). Kh ả năng phân bi ệt c ủa b ộ PowerPlex® Y23 System là 97% c ũng nhi ều h ơn đáng k ể so v ới b ộ YPlus là 93%. Nh ư v ậy dù có s ố lượng Y-STR ít h ơn nh ưng t ập h ợp Y-STR kích th ước < 220 bp trong b ộ PowerPlex® Y23 System lại có kh ả năng phân bi ệt t ốt h ơn so v ới t ập h ợp trong b ộ YPlus. Điều này được lý gi ải do trong s ố các locus có kích th ước ng ắn thu ộc b ộ PowerPlex® Y23 System có 2 locus có độ đa hình cao là DYS481 (GD: 0.77) và DYS635 giúp t ăng đáng k ể kh ả năng phân bi ệt. Kết qu ả phân tích kh ả năng t ạo l ập h ồ sơ Y-STR c ũng g ợi ý vi ệc thi ết k ế và l ựa ch ọn các Y-STR trong b ộ kit th ươ ng m ại để đảm b ảo v ừa có kh ả năng phân tích m ẫu có ADN bị phân hu ỷ, ADN nồng độ th ấp v ừa có kh ả năng t ạo haplotype có độ đa d ạng cao. Có th ể nói bên c ạnh các STR trong nhân, Y-STR là các ch ỉ th ị lý t ưởng trong vi ệc xác định quan h ệ huy ết th ống, định danh cá th ể, điều tra hình s ự. 3.4.2. Hi ệu qu ả sử dụng Y-STR trong phân tích m ẫu l ẫn (mixture sample) Trong nghiên c ứu này, chúng tôi đã th ử phân tích 50 m ẫu l ẫn v ới c ả 2 b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus nh ằm đánh giá kh ả năng t ạo h ồ sơ Y-STR hoàn ch ỉnh c ủa c ả 2 b ộ kit. Nh ững m ẫu này đều là m ẫu d ịch trong âm đạo c ủa n ạn nhân nữ thu th ập t ừ vụ giám định án hi ếp dâm/t ấn công tình d ục tại Khoa Y sinh h ọc, Vi ện Pháp y qu ốc gia. Phân tích các STR trong nhân b ằng b ộ kit Powerplex® fusion system (Promega) trong nh ững m ẫu này đều cho th ấy h ồ sơ ADN thu được ch ủ yếu ở dạng m ẫu l ẫn gi ữa nam và n ữ nên không th ể được s ử dụng để truy nguyên cá th ể. Hình 3.6. Đồ th ị so sánh kh ả năng t ạo h ồ sơ Y-STR s ử dụng b ộ PowerPlex® Y23 System và Yplus Kết qu ả cho th ấy vi ệc s ử dụng bộ kit PowerPlex® Y23 System cho s ố lượng h ồ sơ Y-STR hoàn ch ỉnh nhi ều h ơn b ộ kit YPlus. Ng ược l ại s ố mẫu ch ỉ lên được 1 ph ần và không lên được t ất c ả các locus Y- STR c ủa b ộ kit YPlus l ại nhi ều h ơn so v ới b ộ PowerPlex® Y23 System. Có m ột s ố nguyên nhân lý gi ải k ết qu ả. Th ứ nh ất, do s ố lượng locus Y-STR trong b ộ kit YPlus nhi ều h ơn b ộ PowerPlex® Y23 System nên v ề lý thuy ết t ỷ lệ khu ếch đại thành công t ất c ả các Y-STR s ẽ th ấp h ơn. Th ứ hai, ph ần l ớn các locus m ới được bổ sung trong b ộ YPlus đều có kích th ước l ớn nên s ẽ khó khu ếch đại thành công đặc bi ệt là nh ững m ẫu có đã b ị phân hu ỷ ADN bị đứt gãy nhi ều ho ặc m ẫu có n ồng độ ADN th ấp. Ngoài ra các mẫu ADN có ngu ồn 18
21. 19 gốc t ừ hi ện tr ường v ụ án th ường có ch ứa các ch ất ức ch ế ph ản ứng PCR nh ư axit tannic và axit humic. PowerPlex® Y23 System và YPlus cho th ấy độ nh ạy t ươ ng t ự nh ưng PowerPlex® Y23 System cho th ấy kh ả năng ch ịu axit humic cao h ơn YPlus theo nghiên c ứu tr ước đó. Do đó, PowerPlex® Y23 System sẽ là một b ộ phù h ợp h ơn để phân tích các m ẫu thu th ập t ừ hi ện tr ường v ụ án – là d ạng m ẫu có th ể dễ dàng b ị ô nhi ễm b ởi điều ki ện môi tr ường. Nh ư v ậy v ới vi ệc phân tích thêm dữ li ệu Y-STR đã giúp b ổ sung thông tin, t ăng t ỷ gi ải quy ết thành công trong các tr ường h ợp có mẫu l ẫn, h ỗ tr ợ đáng k ể cho vi ệc đư a ra k ết lu ận cho v ụ án. 3.4.3. Hi ệu qu ả trong vi ệc t ăng kh ả năng phân bi ệt gi ữa các cá th ể So v ới các b ộ kit tr ước đây mà ph ổ bi ến nh ất là b ộ Yfiler g ồm 17 ch ỉ th ị Y-STR, trong b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus đã b ổ sung thêm 12 locus. Các locus m ới được b ổ sung đã đem l ại nh ững ưu th ế đáng k ể cho 2 b ộ kit trên. Đây c ũng là nh ững locus l ần đầu tiên được kh ảo sát trong qu ần th ể ng ười Kinh, Vi ệt Nam khi so sánh v ới các nghiên c ứu tr ước đó. Vi ệc b ổ sung thêm 2 locus đa b ản sao trong b ộ kit YPlus và PowerPlex® Y23 System (là locus có nhi ều h ơn 1 phiên b ản STR ở nh ững v ị trí khác nhau trên NST Y) so v ới các b ộ kit tr ước đó. DYF387S1a/b và DYSS385a/b ch ứng t ỏ là các locus có độ đa d ạng gen cao góp ph ần đáng k ể trong vi ệc t ăng kh ả năng phân bi ệt c ủa b ộ kit này. Ngoài ra trong s ố 29 ch ỉ th ị Y-STR có 7 Y-STR là các locus có t ốc độ đột bi ến nhanh (rapidly mutating Y-STR, g ọi t ắt là RM Y-STR). B ộ kit PowerPlex® Y23 System bổ sung 02 RM Y-STR là DYS570, DYS576; b ộ kit YPlus b ổ sung c ả 7 RM Y-STR Các RM Y-STR có vai trò quan tr ọng trong vi ệc phân bi ệt gi ữa các cá th ể nam có quan h ệ huy ết th ống g ần g ũi (ví d ụ: anh trai - em trai, b ố - con trai). Để đánh giá hi ệu qu ả của các locus m ới được b ổ sung trong 2 b ộ kit PowerPlex® Y23 System và YPlus chúng tôi c ũng l ập b ảng so sánh giá tr ị HD, DC v ới các t ổ hợp Y-STR khác nhau th ường được dùng trong phân tích hình s ự. Các t ổ hợp bao g ồm: - Bộ haplotype t ối thi ểu (MHT - European Minimal Haplotype) bao g ồm 9 locus: DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392 và DYS393. - Bộ haplotype theo khuy ến cáo c ủa Hi ệp h ội Các nhà khoa h ọc làm vi ệc trong l ĩnh v ực phân tích ADN (SWGDAM): bao g ồm 9 locus c ủa b ộ MHT và 2 locus: DYS438, DYS439. - Bộ AmpFLSTR™ Yfiler™ PCR Amplification Kit (g ọi t ắt là Yfiler, hãng ThermoFisher) được phát tri ển vào n ăm 2004 g ồm 11 locus theo khuy ến cáo c ủa SWGDAM k ể trên và 6 locus m ới có độ đa hình cao là: DYS437, DYS448, DYS456, DYS458, Y GATA H4, DYS635. - Bộ PowerPlex® Y23 System và b ộ YPlus: bao g ồm 17 locus nêu trên và thêm các locus m ới. 19
22. 20 Bảng 3. 7. So sánh s ố lượng haplotype quan sát được và các ch ỉ số th ống kê thu được t ừ tập h ợp các marker Y-STR trong các b ộ haplotype t ừ dữ li ệu 200 m ẫu v ới b ộ PowerPlex® Y23 System (PPY23) Bộ haplotype Bộ haplotype Bộ Số haplotype Bộ PPY23 tối thi ểu SWGDAM Yfiler quan sát được (23 locus) (9 locus) (11 locus) (17 locus) Ch ỉ xu ất hi ện ở 1 cá th ể 153 169 192 200 Xu ất hi ện ở 2 cá th ể 11 11 4 0 Xu ất hi ện ở 3 cá th ể 5 0 0 0 Xu ất hi ện ở 4 cá th ể 0 1 0 0 Xu ất hi ện ở 5 cá th ể 2 1 0 0 Xu ất hi ện ở 6 cá th ể 0 0 0 0 Tổng s ố locus 9 11 17 23 Tổng s ố haplotype quan sát 171 182 196 200 HD 0.9977 0.9986 0.9958 1 DC 86% 91% 98% 100% Kết qu ả so sánh cho th ấy vi ệc gia t ăng s ố lượng các marker Y-STR trong phân tích (t ừ 9 marker ở bộ Haplotype Y c ơ b ản lên 23-27 marker ở bộ YPlus) s ẽ làm gia t ăng đáng k ể số haplotype độc nh ất (ch ỉ xu ất hi ện ở 1 cá th ể nam duy nh ất trong qu ần th ể nghiên c ứu), gi ảm s ố lượng các haplotype xu ất hi ện ở 2 ng ười tr ở lên. Qua đó làm t ăng t ổng s ố haplotype quan sát được t ừ 171 -173 haplotype (B ộ 9 locus) -> 193 - 196 haplotype (B ộ 17 locus) lên 200 haplotype (B ộ 23 và 27 locus). T ừ đó độ đa d ạng haplotype và kh ả năng phân bi ệt c ũng được gia t ăng. C ụ th ể giá tr ị DC t ăng t ừ 86% ở bộ MHT-> 98 % ở bộ Yfiler lên 100% ở bộ PowerPlex® Y23 System và YPlus. Từ các k ết qu ả của nghiên c ứu chúng tôi c ũng đã m ạnh d ạn áp d ụng vi ệc phân tích các ch ỉ th ị Y- STR t ừ hai b ộ kit PowerPlex® Y23 System và Yfiler Plus trong các công tác giám định t ại Khoa Y sinh học và đạt được nhi ều k ết qu ả. Trong giám định huy ết th ống, các ch ỉ th ị Y-STR được s ử dụng giám định trong nh ững tr ường h ợp không còn m ẫu ng ười b ố so sánh, xác định m ối quan h ệ huy ết th ống gi ữa nh ững ng ười cùng dòng cha nh ư anh – em trai, ông n ội/chú/ bác – cháu trai. Đặc bi ệt v ới m ột s ố tr ường h ợp xét nghi ệm huy ết th ống cha – con mà có s ự sai khác t ại 1 ho ặc 2 locus - nghi ng ờ do đột bi ến ho ặc l ỗi phân tích, chúng tôi c ũng áp d ụng phân tích m ở rộng b ộ Y-STR để đảm b ảo đư a ra k ết lu ận chính xác nh ất. 3.4.4. Ứng d ụng ch ỉ th ị Y-STR để so sánh kho ảng cách di truy ền gi ữa các qu ần th ể Kho ảng cách di truy ền là th ước đo s ự khác bi ệt di truy ền gi ữa các loài ho ặc gi ữa các qu ần th ể trong một loài, có th ể là đo kho ảng cách th ời gian t ừ tổ tiên chung hay m ức độ của s ự phân hóa. Các qu ần th ể càng có nhi ều alen t ươ ng t ự có kho ảng cách di truy ền càng nh ỏ. Điều này ch ỉ ra r ằng chúng có liên quan ch ặt ch ẽ và có t ổ tiên chung g ần đây. Do ki ểu di truy ền đặc tr ưng c ủa nam gi ới và b ản ch ất đơ n b ội c ủa nhi ễm s ắc th ể Y, các ch ỉ th ị trên NST Y có độ nh ạy cao h ơn so v ới các ch ỉ th ị trên NST th ường trong vi ệc đánh giá s ự trôi d ạt di truy ền (genetic drift) và hi ệu ứng sáng l ập. Y-STR được s ử dụng r ộng rãi để đánh giá c ấu trúc ho ặc s ự khác bi ệt trong qu ần th ể bằng cách ki ểm tra kho ảng cách di truy ền theo c ặp. Trong 20
23. 21 nghiên c ứu này công c ụ online AMOVA trên www.yhrd.org được s ử dụng để tính toán kho ảng cách di truy ền d ựa vào so sánh theo c ặp (giá tr ị Rst) và xác su ất k ết h ợp (P value) gi ữa qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam trong nghiên c ứu v ới s ố li ệu đã được công b ố tr ước đây c ủa 18 qu ần th ể khác trên th ế gi ới. Giá tr ị Rst càng nh ỏ và P-value càng l ớn th ể hi ện kho ảng cách di truy ền g ần và không có ý ngh ĩa khác bi ệt gi ữa các qu ần th ể. K ết qu ả cho th ấy qu ần th ể ng ười Kinh (Vi ệt Nam) trong nghiên c ứu có ý ngh ĩa khác bi ệt nh ất so v ới qu ần th ể ng ười Châu Phi và châu Âu (Namibia và B ỉ) v ới Rst > 0.2, P < 0.001. Ng ược lại, qu ần th ể ng ười Kinh, Vi ệt Nam có kho ảng cách di truy ền khá gần v ới qu ần th ể ng ười Thái Lan và ng ười Hán (Trung Qu ốc) h ơn so v ới các qu ần th ể ng ười châu Á khác. Trong đó kho ảng cách di truy ền gi ữa ng ười Kinh (Vi ệt Nam) và ng ười Thái Lan (Rst =0.0085, P = 0.0157) là g ần g ũi nh ất. Kho ảng cách di truy ền g ần gũi gi ữa quần th ể ng ười Kinh, Vi ệt Nam và ng ười Thái Lan c ũng đã được đề cập trong m ột s ố nghiên c ứu. Cụ th ể dự án h ệ gen ng ười Vi ệt Nam công b ố năm 2019 cho th ấy ng ười Kinh và Thái có s ự tươ ng đồng cao trong b ộ gen và m ối quan h ệ ti ến hóa ch ặt ch ẽ. Vi ệc phân c ụm ho ặc chia tách các qu ần th ể có th ể được hình dung rõ b ằng cách s ử dụng phân tích t ỷ lệ đa chi ều (MDS) d ựa trên s ự gi ống nhau c ủa kho ảng cách di truy ền theo c ặp gi ữa các qu ần th ể trong không gian đa chi ều nh ờ công c ụ AMOVA (hình 3.7). Hình 3.7. Sơ đồ bi ểu th ị kho ảng cách di truy ền gi ữa các qu ần th ể trong không gian 2 chi ều Quan tr ọng h ơn, so sánh kho ảng cách di truy ền gi ữa t ập h ợp b ộ haplotype Y c ơ b ản (MHT) c ủa 400 mẫu t ừ nghiên c ứu này và các qu ần th ể Vi ệt Nam khác đã được công b ố trên YHRD cho th ấy s ự chênh l ệch giá tr ị Rst không đáng k ể. Điều này g ợi ý kho ảng cách t ối thi ểu gi ữa các nhóm m ẫu và ch ỉ ra các qu ần th ể dân t ộc trong Vi ệt Nam nói chung t ươ ng đối t ươ ng đồng, ít có sai khác trong c ấu trúc di truy ền. Qua các phân tích trên có th ể nói ti ềm n ăng ứng d ụng c ủa các ch ỉ th ị Y-STR là r ất l ớn góp ph ần b ổ sung d ữ li ệu trong nhi ều lo ại xét nghi ệm ADN khác nhau. K ết qu ả của lu ận án v ới t ổng c ộng 29 Y-STR 21
24. 22 thu ộc 2 b ộ kit th ươ ng m ại ph ổ bi ến và 10 ch ỉ th ị mini Y-STR đã được nghiên c ứu, kh ảo sát đã chỉ rõ nh ững ch ỉ th ị Y-STR có độ đa hình và hi ệu qu ả khu ếch đại cao áp d ụng trên nhi ều loài là c ơ s ở để lựa ch ọn và phát tri ển b ộ ch ỉ th ị phân tích riêng cho nam gi ới ng ười Vi ệt Nam. CH ƯƠ NG IV. KẾT LU ẬN VÀ KI ẾN NGH Ị Kết lu ận 1. Trong nghiên c ứu, chúng tôi đã kh ảo sát đặc điểm c ủa 29 ch ỉ th ị Y-STR trong qu ần th ể nam gi ới phân b ố ở mi ền B ắc, Vi ệt Nam. C ụ th ể: - Bảng t ần su ất ph ản ánh nh ững đặc tr ưng trong c ấu trúc di truy ền c ủa qu ần th ể nam gi ới ng ười Kinh, Vi ệt Nam khi so sánh v ới các qu ần th ể khác và có ý ngh ĩa trong tính toán ch ỉ số quan h ệ huy ết th ống theo dòng cha. - Kết qu ả kh ảo sát c ũng cho th ấy m ột s ố ch ỉ th ị có độ đa hình cao > 0.7 (chi ếm 55.2% t ổng s ố locus kh ảo sát) h ứa h ẹn là các locus có độ đa hình cao, có ti ềm n ăng l ớn trong vi ệc phân bi ệt các cá th ể nam trong qu ần th ể ng ười Kinh, Vi ệt Nam. - Kết qu ả kh ảo sát s ử dụng hai b ộ kit Y-STR ph ổ bi ến hi ện nay là PowerPlex®Y23 system (Promega) và b ộ Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific) c ũng cho kh ả năng phân bi ệt 100% các cá th ể trong t ập h ợp 400 m ẫu nghiên c ứu. 2. Xây d ựng thành công quy trình khu ếch đại 10 mini Y-STR là nh ững ch ỉ th ị có kích th ước nh ỏ dưới 200bp, độ đa hình cao. K ết qu ả phân tích v ới các m ẫu đã b ị phân h ủy cho th ấy t ỷ lệ khu ếch đại c ủa 10 mini Y-STR dao động từ 44 % đến 82% s ẽ góp ph ần b ổ sung d ữ li ệu khi k ết qu ả phân tích v ới ch ỉ th ị Y-STR thông th ường không thành công. 3. K ết qu ả kh ảo sát trên các m ẫu th ực t ế cho th ấy các 29 ch ỉ th ị Y-STR và 10 mini Y-STR có ti ềm năng cao trong nhi ều h ướng ứng d ụng: - Trong xét nghi ệm huy ết th ống theo dòng cha, phân tích m ẫu có ch ất l ượng kém, m ẫu đã b ị phân hủy, m ẫu l ẫn t ừ nhi ều ngu ồn ADN. Tùy vào nhu c ầu phân tích có th ể lựa ch ọn lo ại ch ỉ th ị Y-STR phù h ợp. - Nghiên c ứu c ấu trúc di truy ền qu ần th ể: k ết qu ả so sánh t ần su ất, độ phân b ố 29 ch ỉ th ị Y-STR trong nghiên c ứu cho th ấy c ấu trúc di truy ền khá đồng nh ất gi ữa các nhóm dân t ộc trong qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam và có kho ảng cách di truy ền g ần g ũi nh ất v ới qu ần th ể ng ười Thái Lan. Ki ến Ngh ị Nhóm nghiên c ứu xin đư a ra m ột số ki ến ngh ị để nghiên c ứu được hoàn thi ện trong th ời gian t ới: 22
25. 23 1. Ti ến hành kh ảo sát thêm t ần su ất phân b ố alen các ch ỉ th ị Y-STR v ới các nhóm dân t ộc khác ph ổ bi ến trong qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam, đặc bi ệt là t ần su ất các locus có độ đa hình cao. 2. Phát tri ển ph ươ ng pháp khu ếch đại các mini Y-STR và các ch ỉ th ị Y-STR có độ đa hình cao b ằng mồi g ắn hu ỳnh quang và điện đi mao qu ản để tạo nên b ộ kit riêng cho ng ười Vi ệt Nam. NH ỮNG ĐÓNG GÓP M ỚI C ỦA LU ẬN ÁN 1. Đây là nghiên c ứu đầu tiên ở Vi ệt Nam kh ảo sát toàn di ện 29 ch ỉ th ị Y-STR trong qu ần th ể nam gi ới dân t ộc Kinh, Vi ệt Nam v ới t ổng c ộng 400 m ẫu nghiên c ứu và s ố ch ỉ th ị Y-STR l ớn h ơn so v ới nghiên cứu tr ước đây trong qu ần th ể ng ười Kinh, Vi ệt Nam. Nghiên c ứu đã xây d ựng b ảng phân b ố tần su ất alen của 29 ch ỉ th ị Y-STR là c ơ s ở để tính toán độ hi ếm c ủa m ột h ồ sơ ADN trong qu ần th ể cũng nh ư ch ỉ số có quan h ệ họ hàng (kinship index) gi ữa các h ồ sơ ADN. K ết qu ả nghiên đã tìm ra nh ững ch ỉ th ị Y-STR có số alen l ớn, độ đa hình cao, ti ềm n ăng ứng d ụng l ớn trong phân bi ệt gi ữa các cá th ể nam nh ư DYS385, DYF387S1, DYS518, DYS 627, DYS458 và các ch ỉ th ị có alen hi ếm g ặp trong qu ần th ể. 2. Đây là nghiên c ứu đầu tiên ở Vi ệt Nam th ực hi ện vi ệc kh ảo sát các mini Y-STR - là các ch ỉ th ị có kích th ước ng ắn d ưới 200 bp, có hi ệu qu ả cao trong vi ệc phân tích các m ẫu đã b ị phân h ủy so v ới các ch ỉ th ị Y-STR thông th ường trong b ộ kit th ươ ng m ại. 3. Nghiên c ứu đã kh ảo sát ti ềm n ăng ứng d ụng c ủa các ch ỉ th ị Y-STR trong b ộ kit th ươ ng m ại và các mini Y-STR theo nhi ều h ướng m ới trong lĩnh v ực giám định pháp y t ại Vi ệt Nam bao g ồm: giám định các m ẫu có quan h ệ huy ết th ống theo dòng cha, giám định m ẫu trong khoa h ọc hình s ự đặc bi ệt là v ới tr ường hợp m ẫu l ẫn gi ữa nam và n ữ, giám định m ẫu lâu n ăm, m ẫu đã b ị phân hu ỷ. Bên c ạnh đó k ết qu ả từ 400 h ồ sơ Y-STR còn được ứng d ụng để xây d ựng kho ảng cách di truy ền gi ữa qu ần th ể ng ười Vi ệt Nam trong nghiên c ứu v ới các nhóm qu ần th ể khác trên th ế gi ới. DANH M ỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG B Ố 1. Hà H ữu H ảo, Lê Tu ấn Anh, Chu Th ị Th ủy, Đinh Th ị Lan, Hoàng Thái Thanh, Nguy ễn Th ị Ph ươ ng Liên, Ph ạm Th ị Trà (2018), “Nghiên c ứu tính đa hình c ủa 6 locus Y - STR m ới trong qu ần th ể dân t ộc Kinh tại Vi ệt Nam”, Tạp chí Y h ọc th ực hành , s ố 7 (1073), 6-9. 2. Hà H ữu H ảo, Nguy ễn Đức Nh ự, Lê Tu ấn Anh, Chu Th ị Th ủy, Đinh Th ị Lan, Hoàng Thái Thanh, Nguy ễn Th ị Ph ươ ng Liên, Chu Hoàng Hà, Lê V ăn S ơn (2018), “ Đặc điểm di truy ền c ủa 27 Locus Y-STR trong qu ần th ể ng ười kinh, Vi ệt Nam s ử dụng b ộ Yfiler Plus PCR Amplication Kit”, Báo cáo khoa h ọc, H ội ngh ị Khoa h ọc Công ngh ệ sinh h ọc toàn qu ốc 2018, 564-569. 23
26. 24 3. Hao Huu Ha , Trang Hong Nguyen, Linh Huyen Tran, Hanh Thi Hong Nguyen, Ha Hoang & Hoang Ha Chu (2019), “Genetic characteristics of 23 Y-chromosomal STRs in the Kinh population in Northern Vietnam”, International Journal of Legal Medicine , volume 133: 1403–1404. 4. Hà H ữu H ảo, Lê Tu ấn Anh, Chu Th ị Th ủy, Đinh Th ị Lan, Hoàng Thái Thanh, Nguy ễn Th ị Ph ươ ng Liên (2019), “Nghiên c ứu và ứng d ụng các mini y-str trong giám định các m ẫu đã b ị phân h ủy t ại Vi ện pháp y qu ốc gia”, Tạp chí Y h ọc th ực hành , s ố 11 (1128), 6-9. 5. Hao Huu Ha , Nhu Nguyen Duc, Anh Le Tuan, Thuy Thi Chu, Lan Dinh Thi, Lien Nguyen Thi Phuong, Thanh Hoang Thai (2020), A case study on sexual assault involving an individual with a large 24 Y chromosome deletion and two X chromosomes genotype . The Asian sciences network newsletter, Issue 10: 24-25. 24