Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và mốc sương ở miền Bắc Việt Nam

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và mốc sương ở miền Bắc Việt Nam

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ___ TỐNG VĂN HẢI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA KHÁNG BỆNH XOĂN VÀNG LÁ VÀ BỆNH MỐC SƯƠNG Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 HÀ NỘI - 2022
2. Công trình được công bố tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Phan Hữu Tôn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Viện: Họp tại: Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2022. Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2. Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
3. 1 MỞ ĐẦU 1. Tínhc cấp thiết của đề tài nghiên cứu Cà chua là cây rau ăn quả có tên khoa học Lycopercicum esculentum Mill, được trồng hầu hết các nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Ở Việt Nam, cà chua được trồng và tiêu thụ phổ biến trên cả nước. Số liệu thống kê năm 2020, diện tích trồng cà chua cả nước năm 2019 là 23,719 nghìn ha và sản lượng đạt 673.194,5 tấn 4. Sản xuất cà chua đem lại hiệu quả kinh tế cao, cứ 01 ha cà chua cho thu nhập từ 120-200 triệu đồng/ha/vụ, ở vụ Xuân hè và Thu đông cây cà chua cho hiệu quả cao gấp 3-5 lần so với chính vụ 18, 22. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng của cà chua của Việt Nam còn bấp bênh và chưa cao, nguyên nhân là do các loại bệnh hại gây hại, trong đó bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương là hai bệnh gây hại nghiêm trọng nhất. Bệnh xoăn vàng lá cà chua có tên tiếng Anh là Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) do một số loài virus thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae gây ra, được phát hiện lần đầu tiên ở Israel vào năm 1939 112. Bệnh này làm thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất, chất lượng cà chua. Năng suất thiệt hại trung bình từ 55 - 90%, thậm chí là 100% khi cây bị nhiễm nặng bệnh này 14, 38. TYLCV được lan truyền nhờ loài bọ phấn Bemisia tabaci, đây là loài côn trùng có sức sinh sản nhanh và mạnh, rất khó phòng trừ. Hiện tại chưa có loại thuốc nào phòng trừ hữu hiệu bệnh này, nếu cây bị nhiễm bệnh chỉ có thể nhổ bỏ. Bệnh mốc sương cà chua do nấm Phytophthora infestants gây ra, là một trong những bệnh hủy diệt ở hầu hết các vùng trồng cà chua trên toàn thế giới. Việc kiểm soát bệnh mốc sương chủ yếu dựa vào việc sử dụng thuốc diệt nấm và các biện pháp canh tác. Tuy nhiên, hiệu quả của các biện pháp này không cao do sự biến đổi của các chủng P. infestants, phát sinh các chủng mới, và khả năng kháng thuốc diệt nấm của mầm bệnh tăng lên. Để phòng trừ hai bệnh này thì việc sử dụng giống cà chua kháng là biện pháp hiệu quả nhất, vừa tiết kiệm được chi phí và vừa an toàn với con người, vật nuôi và môi trường 22, 37, 99. Hiện tại bộ giống cà chua có khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương của Việt Nam còn khá khiêm tốn, các giống được trồng phần lớn là bị nhiễm nặng hai bệnh này. Chính vì vậy chọn tạo được giống kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương là nhu cầu rất cấp thiết. Muốn chọn tạo giống cà chua kháng bệnh thành công việc đầu tiên phải xác định được số gen kháng và gen kháng hữu hiệu ở Việt Nam. Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện được 6 gen kháng bệnh xoăn vàng lá cà chua đặt tên lần lượt là Ty1, Ty2, Ty3, Ty4, ty5 và Ty6. Trong
4. 2 đó Ty1, Ty2, Ty3 là những gen chính được sử dụng nhiều trong các chương trình chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá 125. Bên cạnh đó các gen kháng bệnh mốc sương Ph1, Ph2, Ph3, Ph4 và Ph5 cũng được phát hiện 143. Các chỉ thị phân tử DNA liên kết với các gen trên cũng đã được phát triển. Vì vậy dựa trên PCR để phát hiện và chọn lọc các gen kháng đã và đang được sử dụng rộng rãi trong các chương trình chọn giống cà chua, giúp cho việc chọn lọc gen kháng trở nên thuận lợi và chính xác. Trong chương trình hợp tác và trao đổi nguồn gen, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã thu thập được 230 mẫu giống cà chua trong và ngoài nước. Để khai thác được nguồn gen này phục vụ công tác chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và mốc sương thì việc đầu tiên phải đánh giá nguồn gen, ứng dụng chỉ thị phân tử để phát hiện các mẫu giống chứa gen kháng bệnh, lai và sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc. Với mục tiêu chọn được giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương ở miền Bắc Việt Nam”. 2. Mục tiêu của đề tài Bổ sung nguồn vật liệu quý về một số tính trạng như: năng suất, chất lượng quả, các gen kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương, phục vụ cho các chương trình chọn tạo giống cà chua kháng hai bệnh nói trên. Chọn tạo được một số dòng, giống cà chua ưu tú, năng suất cao (trên 50 tấn/ ha), mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá và gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử DNA, đáp ứng nhu cầu về giống cà chua kháng hai bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Bổ sung các dữ liệu khoa học trong nghiên cứu chọn tạo giống cà năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương đáp ứng yêu cầu thực tiễn sản xuất. Kết quả của đề tài mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cà chua theo các tính trạng mục tiêu, đặc biệt là trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương. Luận án là một công trình nghiên cứu khoa học khép kín: Từ nghiên cứu, đánh giá nguồn vật liệu khởi đầu, phát hiện các gen kháng bệnh xoăn vàng lá và gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử, lây nhiễm nhân tạo phát hiện gen kháng bệnh hữu hiệu, lai và ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen kháng, đánh giá chọn dòng ưu tú, khảo nghiệm cơ bản, khảo nghiệm sinh thái để tuyển chọn dòng/ giống ưu tú, từ đó phát triển trong sản xuất.
5. 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Tạo ra nguồn vật liệu đa dạng và phong phú phục vụ hiệu quả trong chương trình chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương. Chọn tạo được 3 dòng/giống cà chua mới, trong đó hai dòng TP130 và TP135 có khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá, dòng P7 có khả năng kháng bệnh mốc sương, các dòng đều cho năng suất ổn định, từ đó phát triển trong sản xuất, đáp ứng được nhu cầu của thực tiễn. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu 230 mẫu giống cà chua thu thập được trong và ngoài nước hiện đang được lưu giữ tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Các chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng virut xoăn vàng lá Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 và ty5, gen kháng bệnh mốc sương Ph2, Ph3 đã được công bố trên các tạp chí trong và ngoài nước. 4.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Các thí nghiệm được thực hiện tại khu thí nghiệm của Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng và phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Học viện nông nghiệp Việt Nam. Các thí nghiệm khảo nghiệm được tiến hành tại Sóc Sơn - Hà Nội, Mộc Châu - Sơn La và Vĩnh Bảo - Hải Phòng. Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 4/2016 - 4/2022 5. Những đóng góp mới của luận án Góp phần xây dựng được bộ cơ sở dữ liệu về đặc điểm nông sinh học của tập đoàn 230 mẫu giống cà chua, phục vụ công tác bảo tồn và khai thác nguồn gen cà chua ở Việt Nam, đặc biệt là nguồn gen mang các gen kháng bệnh xoăn vàng lá và gen kháng bệnh mốc sương. Xác định được các gen kháng tốt với bệnh xoăn vàng lá ở Việt Nam là gen Ty1 và Ty3, gen kháng tốt với bệnh mốc sương là Ph2 và Ph3 thông qua lây nhiễm bệnh nhân tạo. Đây được coi là cơ sở khoa học cho chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương ở miền Bắc Việt Nam. Chọn tạo thành công 3 dòng cà chua thuần, trong đó hai dòng cà chua TP130 mang gen Ty1 và TP135 mang gen Ty3 kháng tốt với bệnh xoăn vàng lá. Dòng P7 mang gen kháng Ph3 kháng tốt với bệnh mốc sương. Tất cả các dòng đều cho năng suất ổn định, đạt trên 50 tấn/ ha trong điều kiện vụ Xuân hè và trên 60 tấn/ha trong điều kiện vụ Đông, có chất lượng quả tốt, kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương, đáp ứng được nhu cầu thực tiễn sản xuất ở miền Bắc Việt Nam.
6. 4 6. Bố cục của luận án: Luận án gồm 136 trang (không kể tài liệu tham khảo và phần phụ lục): Mở đầu (5 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu (41 trang); (Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (14 trang), Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 75 trang), Kết luận và đề nghị (2 trang), Tài liệu tham khảo sử dụng 27 tài liệu Tiếng Việt, 117 tài liệu Tiếng Anh. Luận án có 43 bảng, 47 hình và 02 phụ lục, 03 công trình đã công bố. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU Luận án đã tham khảo và tóm lược các tài liệu Tiếng Việt và Tiếng Anh, với các nội dung liên quan bao gồm: 1. Tình hình sản xuấtt cà chua trên thế giới và ở Việt Nam; 2. Những nghiên cứu về bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương; 3. Nghiên cứu về gen kháng bệnh xoăn vàng lá, bệnh mốc sương và các chỉ thị phân tử ADN liên kết; 4. Chọn tạo giống ứng dụng MAS; 5. Một số nghiên cứu và thành tựu về chọn tạo giống kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương ở Việt Nam. 1.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.1. Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Liên hiệp quốc, diện tích cà chua trong 5 năm 2016-2020 dao động xung quanh 4.900.000 ha, năng suất giao khoảng 36,0 tấn/ ha. Về sản lượng tăng dần, từ 177.382.876 tấn (năm 2016) lên 186.821.216 tấn (năm 2020) 50. Với sản lượng trên, bình quân tiêu thụ đầu người khoảng trên 22 kg quả/người/năm. Cũng trong 5 năm từ năm 2016 đến năm 2020, châu Á có diện tích và sản lượng cà chua lớn nhất thế giới thế giới chiếm khoảng 61,3% tổng sản lượng, tiếp đó là đến châu Mỹ chiểm 13,9% tổng sản lượng. Châu Âu khoảng 12,9 %, châu Phi khoảng 11,6 %, và các nơi khác 0,2 %. 1.1.2. Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê của Cục trồng trọt, Bộ nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong 5 năm từ 2015 đến 2019 diện tích, trồng cà chua dao động trong khoảng 23-25 nghìn ha, năng suất dao động xung quanh 25-28 tấn/ ha. Cà chua phần lớn được sản xuất tại các tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng và khu vực Lâm Đồng. Diện tích và sản lượng cà chua sản xuất ở hai khu vực này chiếm trên 62% sản lượng cà chua cả nước. 1.2. Những nghiên cứu về bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương 1.2.1. Những nghiên cứu về bệnh xoăn vàng lá 1.2.1.1. Nguyên nhân Bệnh xoăn vàng lá cà chua (Tomato Yellow Leaf Curl Disease - TYLCD) do begomovirus gây hại được ghi nhận lần đầu tiên trên thế giới từ
7. 5 những năm 1959 tại Israel. Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1970. 1.2.1.2. Triệu chứng Khi bị bệnh lá cong xuống dưới vào phía bên trong, giai đoạn sau lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chóp lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp. Triệu chứng biến vàng đặc biệt rõ ở các lá non. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng 13, 45, 102. 1.2.1.3. Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được xem là một phức hợp gồm nhiều begomovirus khác nhau gọi chung là virus xoăn vàng lá cà chua - Tomato yellow leaf curl virus 122. Begomovirus là chi lớn nhất trong họ geminivirus. Các begomovirus có bộ gen ADN sợi vòng đơn có kích thước 2.6-2.8 kb. Chúng có bộ gen kép gồm 2 phân tử DNA gọi là DNA-A và DNA- B hoặc có bộ gen đơn tương đương DNA-A 72 và vector lan truyền bệnh là bọ phấn trắng. 1.2.1.4. Vecto lan truyền bệnh Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn 45. Hiện nay, chỉ có ba loài bọ phấn được coi là các vector của virus thực vật bao gồm: Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, và T. abutilonia. Trong đó, B. tabaci là quan trọng nhất, được chứng minh là vector của hơn 100 bệnh virus (chủ yếu là các virus thuộc chi begomovirus) khác nhau trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới 87, 116. 1.2.1.5. Cơ chế lan truyền của virut TYLCV xâm nhập vào cây trồng qua bọ phấn trắng (Bemisia tabaci). Khi nhiễm vào tế bào thực vật, phần DNA vòng đơn của virus sẽ xâm nhập vào nhân của tế bào chủ và sử dụng những nguyên liệu của vật chủ để sao chép và tổng hợp ra protein vỏ, hoàn thiện cấu trúc virus. 1.2.2. Những nghiên cứu về bệnh mốc sương 1.2.2.1. Nguồn gốc và tác hại của bệnh mốc sương Bệnh mốc sương cà chua do nấm Phytophthora infestans gây ra, là một trong những bệnh gây hại hủy diệt ở hầu hết các vùng cà chua trên toàn thế giới. Ở Việt Nam, từ nhiều năm nay bệnh thường xuyên gây hại ở các vùng trồng cà chua, thiệt hại trung bình 63,7 %, có khi lên tới 100% không được thu hoạch 14. 1.2.2.2. Triệu chứng Triệu trứng của bệnh mốc sương là rất đa dạng, nó tuỳ thuộc vào cấp bệnh và điều kiện môi trường, khi cà chua mới chớm bị bệnh trên lá lúc đầu chỉ là một điểm nhỏ (2- 10 mm) và không có giới hạn rõ rệt, mặt dưới lá chỗ có vết bệnh có lớp trắng xốp như sương muối, xuất hiện rõ nhất khi
8. 6 trời ẩm ướt, đó là đám cành bào tử phân sinh của nấm gây bệnh, vết bệnh tiếp tục lan rộng trên bề mặt lá, cuống lá, thân cành, quả. 1.2.2.3. Phân loại và đặc điểm sinh học của nấm bệnh mốc sương P. infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes), bộ nấm sương mai (Peronosporales), lớp nấm này thuộc một giới khác với giới nấm thật (true fungi). Một số tác giả cho rằng lớp nấm trứng thuộc về giới Protoctista một số khác thì cho rằng nó thuộc giới Chromista 7. Đặc điểm chủ yếu của P. infestans là sợi nấm đơn bào khá phát triển, là loại nấm có chu kỳ phát triển hoàn toàn, nhưng ở điều kiện nhiệt đới chỉ thấy xuất hiện giai đoạn sinh sản vô tính và do đó chúng buộc phải ký sinh trên ký chủ. 1.2.2.4. Phân bố địa lý và phạm vi ký chủ của bệnh mốc sương P. infestans là loài nấm dị tản có hai dạng (matin type) A1 và A2 tuỳ theo vùng sinh thái ở các vùng trồng cà chua và khoai tây trên thế giới. Trên thực tế nấm gây bệnh được coi là loài ký sinh chuyên tính và có phổ ký chủ hẹp, song P. infestans đã được ghi nhận là gây bệnh trên nhiều loài cây. 1.3. Nghiên cứu về gen kháng bệnh xoăn vàng lá, bệnh mốc sương và các chỉ thị phân tử ADN liên kết 1.3.1. Những nghiên cứu về gen kháng bệnh xoăn vàng lá và các chỉ thị Cho đến nay các nhà khoa học đã phát hiện được 6 gen kháng bệnh xoăn và lá cà chua đặt tên lần lượt là Ty1, Ty2, Ty3, Ty4, ty5 và Ty6. Trong đó Ty1, Ty2, Ty3 là những gen chính được sử dụng nhiều trong các chương trình chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá 125. Gen Ty1 là gen trội, được Zamir và cộng sự xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 6 139. Sau này các nhà khoa học đã xác định được các chỉ thị phân tử liên kết với gen này. Castro & cs (2007) đã xác định được chỉ thị JB-1 liên kết với gen Ty1. Tuy nhiên, chỉ thị JB1 là chỉ thị trội nên không phân biệt được kiểu gen kháng đồng và dị hợp tử. Tiếp theo, Han & cs (20120 đã phát triển thành công chỉ thị đồng trội CAPS TG97 cho phép phân biệt được kiểu gen kháng đồng và dị hợp tử. Gen Ty2 được Hanson & cs (2006) xác định nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể 11, nằm giữa chỉ thị TG36 và TG26 61. Sau đó Garcia & cs (2007) đã phát triển chỉ thị SCAR T0302 liên kết với gen này. Sử dụng cặp mồi T0302F/TY2R1, cho phép phát hiện được được gen Ty2 ở ba trạng thái khác nhau, đồng hợp tử trội, dị hợp tử và đồng hợp tử lặn 53. Gen Ty3 là gen trội nằm trên nhiễm sắc thể số 6 73, 78. Theo Ji & cs (2007) gen Ty3 định vị tại một vùng có chứa locus FER (25 cM, dòng vector BAC56B23, AY678298). Các chỉ thị phân tử ADN liên kết với gen Ty3 là T0507, C2_At3g11210 và P6-25 đều chỉ ra sự hiện diện của gen Ty3. Tuy nhiên chỉ thị T0507 và C2_At3g11210 là trội, P6-25 là đồng trội. Ngoài ra một số lượng lớn các chỉ thi liên kết Ty3 cũng đã được tìm ra, cụ thể là P169C, TG118, TG590 và FERG8, nhưng không phân biệt các dòng
9. 7 mang Ty3 ở các trạng thái alen khác nhau. Gen Ty4 là gen trội được phát hiện bởi Ji & cs (2008). Tác giả đã phát hiện một vùng chuyển vị S. Chilense 14cM trên nhánh dài của NST số 3 trong một số dòng giống kháng có nguồn gốc từ LA1932. Một locus kháng begomovirus mới là Ty4 được lập bản đồ với các marker vào khoảng 2,3 cM giữa C2_At4g17300 và C2_At5g60160 trong vùng chuyển vị khoảng 550 kb trên nhiễm sắc thể số 3 74, 77. Chỉ thị C2_AT5g51110 được xác định là liên kết với gen này 74. Gen ty5 là gen lặn được định vị trên nhiễm sắc thể số 4 31. Gen ty5 là gen lặn nên không có ý nghĩa nhiều trong chọn tạo giống cà chua lai nhưng lại có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cà chua thuần. Chỉ thị phân tử DNA liên kết với gen ty5 cũng đã được phát hiện, đó là chỉ thị TM719 42. 1.3.2. Những nghiên cứu về gen kháng bệnh mốc sương và các chỉ thị liên kết Đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã xác định được 6 gen kháng bệnh mốc sương khác nhau là: Gen Ph1 trên nhiễm sắc thể số 7, Ph2 trên nhiễm sắc thể số 10 101, Ph3 trên nhiễm sắc thể số 9 143, Ph4 trên nhiễm sắc thể số 2 22 và Ph5-1, Ph5-2 trên nhiễm sắc thể số 1 và 10 96 , 97. Trong đó, các gen Ph1, Ph2 và Ph3 đã được sử dụng phổ biến để tạo ra các giống cà chua kháng. Cùng với việc phát hiện ra các gen kháng, các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu các chỉ thị phân tử ADN liên kết với các gen kháng đó. Tuy nhiên không có chỉ thị nào được công bố liên kết với gen Ph1, trong khi đó chỉ thị UF-Ph2-1 liên kết với gen Ph2 117, chỉ thị SCAR-SCU602 liên kết với gen Ph3 đã được công bố 132. 1.4.Chọn tạo giống ứng dụng MAS 1.4.1. Khái niệm Marker assisted selection (MAS) là “chọn giống thông minh” hoặc công nghệ chọn giống cây trồng nhanh và chính xác. Nó là một công cụ được sử dụng trong các Viện nghiên cứu, các công ty để phát triển nhanh các giống cải tiến, mang lại khả năng chọn lọc các tính trạng mong muốn bằng cách sử dụng các dấu hiệu DNA. 1.4.2. MAS trong chọn tạo giống kháng bệnh 1.4.3. MAS trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và mốc bệnh sương Trong số các loại cây họ cà, cà chua là một trong những loại cây được nghiên cứu nhiều nhất dựa trên các nghiên cứu về gen. MAS là một phương pháp chọn lọc gián tiếp tính trạng dựa trên kiểu gen của một điểm đánh dấu liên quan thay vì đặc điểm quan tâm 108. Trong vài thập kỷ qua, MAS là kỹ thuật được các nhà lai tạo sử dụng phổ biến nhất để phát triển các giống cây trồng mới. Ngoài ra, MAS là một cách xây dựng để quy
10. 8 tụ gen hoặc xác định các locus tính trạng số lượng (QTL), đặc biệt đối với các tính trạng có hệ số di truyền thấp 71. 1.4.3.1. Các nghiên cứu MAS trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn lá Những phát hiện ra các gen kháng bệnh xoăn vàng lá và các chỉ thị liên kết là tiền đề cho chọn tạo giống cà chua kháng bệnh. Mặc dù nhiều gen kháng TYLCV đã được nghiên cứu, nhưng hầu hết các giống cà chua thương mại đều có một gen kháng TYLCV duy nhất, thường là gen Ty1 hoặc Ty3. Sự xuất hiện của các chủng TYLCV mới kháng lại Ty1/3, hoặc bùng phát kháng Ty1/3 do các điều kiện môi trường cụ thể, đã nhiều lần được báo cáo 107. Do đó, phải quy tụ nhiều gen kháng vào một giống cà chua là cần thiết để đạt được khả năng kháng TYLCV lâu bền và đáng tin cậy118. Việc sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc gen kháng mục tiêu (MAS) là điều cần thiết cho các chương trình quy tụ nhiều gen kháng vào một giống hiệu quả 88. 1.4.3.2. Các nghiên cứu MAS trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương Năm gen kháng bệnh mốc sương đã được chuyển từ S. pimpinellifolium vào cà chua trồng 106 và gen kháng Ph2 và Ph3 đã được sử dụng rộng rãi trong các giống cây thương mại 141. Con lai F1 với các gen Ph2 và Ph3 kết hợp được thương mại hóa ở Hoa Kỳ 46. Cũng tương tự như chọn lọc gen kháng bệnh xoăn vàng lá bằng MAS thì chỉ thị phân tử là tiền đề để chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương. Việc ứng dụng MAS để quy tụ nhiều gen vào một giống sẽ tạo ra tính kháng mạnh và bền vững hơn. Việc không ngừng nghiên cứu để có được chỉ thị liên kết chặt với các gen đóng vai trò là chìa khóa. 1.5. Một số nghiên cứu và thành tựu về chọn tạo giống kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương ở Việt Nam Ở Việt Nam công tác chọn tạo giống cà chua được quan tâm từ những năm 1970. Tuy nhiên chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương trong những năm gần đây mới được quan tâm. 1.5.1. Những nghiên cứu và thành tựu trong chọn tạo giống kháng bệnh xoăn vàng lá của Việt Nam Những nghiên cứu chọn tạo giống cà chua ở Việt Nam khá nhiều và đã chọn tạo được giống cà chua cho năng suất cao, có khả năng chịu nóng. Tuy nhiên bộ giống kháng bệnh xoăn vàng lá còn khá khiêm tốn. Giống cà chua lai VT15 của viện Cây lương thực và Cây thực phẩm chọn tạo có chứa hai gen kháng là Ty2 và Ty3 kháng tốt với bệnh xoăn vàng lá. Các nghiên cứu khác như của Trần Ngọc Hùng & cs (2020) hay của Phan Hữu Tôn &
11. 9 cs (2013) chỉ dừng ở việc đánh giá và phát hiện được các gen kháng Ty1, Ty2, Ty3 hoặc chọn ra được dòng mang gen kháng bệnh. 1.5.2. Những nghiên cứu và thành tựu chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương của Việt Nam Ở Việt Nam, điều đáng chú ý là hầu hết các giống được chọn tạo trong thời gian qua chưa hoặc ít chú ý đến tính kháng bệnh mốc sương. Các nghiên cứu của Phan Hữu Tôn & cs (2013) cũng chỉ dừng lại ở phát hiện gen kháng phục vụ chọn tạo giống. Trần Ngọc Hùng & cs (2020) quy tụ gen Ph2 và Ph3 trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương nhưng mới đến thế hệ F5. Một nghiên cứu khác của Trần Ngọc Hùng, chọn lọc bằng chỉ thị phân tử và lây nhiễm nhân tạo đã chọn lọc được dòng cà chua TP85 mang gen kháng bệnh sương mai Ph3 và dòng AV10 mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá Ty2. Từ nguồn vật liệu này tác giả đã tạo ra tổ hợp lai cà chua CVR9 mang đồng thời các gen nói trên. CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu tham gia trong các nghiên cứu bao gồm 230 mẫu giống cà chua được thu thập ở Việt Nam và các nước trên thế giới như Pháp, Iserel, Đài Loan, Nhật, Nga, Trung Quốc Danh mục nguồn vật liệu được trình bày ở bảng 1, phần phụ lục. Giống đối chứng Savior, C155, PT18 được cung cấp bởi Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Nguồn bệnh xoăn vàng lá được thu thập ở Bắc Giang, Hải Phòng, Hưng Yên và 01 cấu trúc xâm nhiễm ToLCHnV (mã GenBank HQ162269) gây bệnh xoăn vàng lá trên cà chua tại Việt Nam 61. 6 isolate bệnh mốc sương thu thập tại Hà Nội, Hải Dương, Thái Bình, Hải Phòng, Thanh Hoá và Sơn La. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học chính của 230 mẫu giống cà chua 2.2.2. Phát hiện gen kháng bệnh xoăn vàng lá và gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử 2.2.3. Xác định gen kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương cà chua hữu hiệu 2.2.4. Lai, chọn tạo giống mới 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.3.1. Địa điểm Các thí nghiệm nghiên cứu đánh giá nguồn vật liệu, dòng chọn lọc,
12. 10 đánh giá và tuyển chọn các dòng ưu tú, lây nhiễm nhân tạo bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương được thực hiện tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng, Học viện Nông nghiệp Nông nghiệp Việt Nam. Các thí nghiệm nghiên cứu phát hiện và chọn lọc gen kháng bệnh xoăn vàng lá và gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam. Khảo nghiệm sinh thái một số dòng/ giống cà chua triển vọng tại huyện Sóc Sơn - Hà Nội, huyện Vĩnh Bảo - Hải Phòng và huyện Mộc Châu - Sơn La. 2.3.2. Thời gian Thời gian thực hiện từ năm 2016 đến năm 2021 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học chính của 230 mẫu giống cà chua Các thí nghiệm khảo sát đánh giá tập đoàn cà chua gồm 230 mẫu giống được bố trí tuần tự, không nhắc lại với giống cà chua C155 làm đối chứng, diện tích ô thí nghiệm là 10m2/giống, trồng 30 cây/ô. Thí nghiệm tiến hành trong vụ Đông năm 2015 và năm 2016 tại Gia Lâm, Hà Nội. Đánh giá nguồn gen theo tiêu chuẩn ngành về khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất, tính ổn định (DUS) đối với cà chua (10TCN 557- 2002), TCN 219-2006 và theo QCVN01-63: 2011/BNNPTNT. 2.4.2. Phương pháp phát hiện gen kháng bệnh xoăn vàng lá và gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử 2.4.2.1. Phương pháp chiết tách DNA DNA được chiết tách từ lá non của cây con 20 ngày tuổi bằng phương pháp CTAB được mô tả bởi Doyle và Doyle (1990) có cải tiến. 2.4.2.1. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng Thành phần phản ứng PCR 20µl gồm: 10 µl PCR 2X master mix của Intron; 1 µl (10 µM) mồi mỗi loại; 7 µl nước và 1 µl DNA tổng số. Chu kỳ nhiệt: Với gen Ty1: 20 chu kỳ đầu ở 94℃/10 giây, 55℃/30 giây và 72℃/70 giây; 10 chu kỳ sau ở 94℃/10 giây, 53℃/30 giây và 72℃/70 giây; kết thúc bằng bước kéo dài ở 72℃/10 phút 60. Với gen Ty2, Ty3, Ty4 và ty5: Biến tính ban đầu ở 94℃/5 phút, sau đó thiết lập 34 chu kỳ gồm 94℃/30 giây, 53℃/1 phút, 72℃/1 phút; kết thúc phản ứng bằng bước kéo dài ở 72℃ /5 phút và giữ ở 4℃. Riêng gen Ty1, 10µl sản phẩm PCR được ủ qua đêm ở 65℃ với 5 đơn vị enzyme TaqI để phân biệt alen kháng và mẫn cảm. Chu kỳ nhiệt với gen Ph2 và Ph3: Biến tính ban đầu 94 °C/3 phút, thiết lập 35 chu kỳ gồm: 94℃/ 1 phút, 55℃ /1 phút, 72℃ /2 phút; kết thúc phản ứng 72℃ /7 phút và giữ ở 4℃. Sản phẩm PCR phát hiện gen Ph2 ủ qua đêm ở 65℃ với 5 đơn vị enzyme HinfI để phân biệt alen kháng và
13. 11 mẫn cảm. Điện di: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X và bổ sung thêm chất nhuộm redsafe. Quan sát hình ảnh điện trong buồng UV. 2.4.3. Phương pháp xác định gen kháng bệnh xoăn vàng lá và mốc sương hữu hiệu bằng lây nhiễm nhân tạo 2.4.3.1. Lây nhiễm nhân tạo bệnh virut xoăn vàng lá Chồi bệnh dài 4-5cm được tách ra từ những cây cà chua có triệu chứng bệnh điển hình thu từ Kiến Thuỵ - Hải Phòng, Văn Giang - Hưng Yên và Việt Yên - Bắc Giang ghép lên giống mẫn cảm Hồng Lan 50 ngày tuổi để nhân và duy trì các nguồn bệnh. Cấu trúc xâm nhiễm ToLCHnV (mã GenBank HQ162269) cũng được lây nhiễm trên giống Hồng lan bằng phương pháp tiêm mặt dưới lá 29 để nhân mẫu bệnh này phục vụ lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp ghép. Các dòng đánh giá được gieo trong nhà lưới để cách ly côn trùng, sau 30 ngày tuổi thì tiến hành ghép nêm với chồi bệnh, vị trí ghép ở phần thân phía trên 3 lá thật đầu tiên, mỗi dòng ghép 10 cây, sau 10 ngày thì trồng ra ruộng. Sau 40 ngày ghép tiến hành đánh giá mức độ năng nhẹ theo thang điểm từ 0 - 4 83: 2.4.3.2. Lây nhiễm nhân tạo bệnh mốc sương Mẫu nấm P. infestans được thu thập tại Sóc Sơn - Hà Nội, Quỳnh Phụ - Thái Bình, Vĩnh Bảo - Hải Phòng, Tứ Kỳ - Hải Dương, Đông Sơn - Thanh Hoá, Mộc Châu - Sơn La trên cây cà chua bị bệnh sương mai điển hình. Nấm bệnh được phân lập theo Sobkowiak và Śliwka 132. Bệnh sương mai được lây bệnh trên lá tách rời. Sau khi gieo 30 - 35 ngày, cây xuất hiện 5 - 6 lá thật. Ngắt lá thật thứ 4 (đã phát triển đầy đủ), sạch bệnh và ghi thẻ đánh dấu tương ứng với mẫu giống nghiên cứu, giữ trong giấy ẩm, mát. Đặt úp lá cà chua lên giấy ẩm trong đĩa Petri, sau đó dùng micropipet nhỏ vào giữa mỗi lá chét 30 µl dung dịch bào tử (104 - 105 bào tử/ml) nấm mốc sương. Với mỗi cây được lây lặp lại 3 lần. Sau khi lây nhiễm, hộp petry được đậy kín lại, giữ trong tủ định ôn 17℃. Đánh giá bệnh sau 7 ngày lây nhiễm dựa theo chỉ số bệnh. 2.4.4. Phương pháp lai, chọn tạo giống mới 2.4.4.1. Phương pháp lai và chọn lọc tạo dòng, giống cà chua mới Quần thể lai F1 được tạo ra bằng phương pháp lai đơn, dòng mẹ là các mẫu giống cà chua tốt đã được đánh giá và sàng lọc, dòng bố là các mẫu giống mang gen kháng Ty hoặc gen Ph. Quần thể F1 được sàng lọc bằng chỉ thị phân tử ADN. Từ quần thể F2 phương pháp chọn lọc phả hệ và chỉ thị phân tử ADN được sử dụng để chọn cá thể mang gen đồng hợp tử. 2.4.4.2. Thí nghiệm so sánh, khảo nghiệm cơ bản và sinh thái Các thí nghiệm so sánh, khảo nghiệm các dòng tốt được bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD), 3 lần nhắc lại, diện tích ô 10m2/ô và trồng 30 cây/ô. Giống đối chứng là giống cà chua C155. Các
14. 12 chỉ tiêu theo dõi, đánh giá theo QCVN01-63: 2011/BNNPTNT. Các dòng cà chua triển vọng được khảo sát ở các vùng sinh thái khác nhau: Hà Nội, Hải Phòng, Sơn La. 2.5. Phương pháp, kỹ thuật chăm sóc cây con Chăm sóc theo quy trình của Viện cây lương thực vầ cây thực phẩm 2.6. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm - Số liệu thống kê sinh học trên đồng ruộng được xử lý trên chương trình Excell 2011 trên máy vi tính. - Phân tích phương sai ANOVA, hệ số biến động Cv(%), sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa LSD0,05, so sánh Duncal, bằng phần mềm IRRISTAT ver. 5.0. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá nguồn gen phục vụ chọn giống cà chua. Để phục vụ công tác chọn tạo giống cà chua, trong khuôn khổ của luận án, 230 mẫu giống cà chua đã được đánh giá về các đặc điểm nông sinh học, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất, từ đó chọn ra các mẫu giống tốt sử dụng làm nguồn vật liệu để lai tạo. 3.1.1. Kiểu hình sinh trưởng Kết quả quan sát đặc điểm sinh trưởng chiều cao và ra hoa của 230 mẫu giống nghiên cứu, nhận thấy có 112 mẫu giống sinh trưởng bán hữu hạn, 49 mẫu giống sinh trưởng hữu hạn, 69 mẫu giống còn lại thuộc kiểu sinh trưởng vô hạn. 3.1.2. Các giai đoạn sinh trưởng Theo dõi về các giai đoạn sinh trưởng nhận thấy: Thời gian từ trồng đến ra hoa có 104 mẫu giống có thời gian từ trồng đến ra hoa trong khoảng từ 26 - 30 ngày và 68 mẫu giống có thời gian từ trồng đến ra hoa là trên 30 ngày. Thời gian từ trồng đến thu quả đợt 1 có 51 mẫu giống chín sớm, 112 mẫu giống chín trung bình, 67 mẫu giống chín muộn. Thời gian từ trồng đến kết thúc thu hoạch hay khi thu hết quả thương phẩm nhận thấy: Thời gian sinh trưởng dao động từ 81 đến 130 ngày. Trong đó 52 mẫu giống có thời gian sinh trưởng ngắn (<110 ngày), 67 mẫu có thời gian sinh trưởng trung bình (111-120 ngày), 42 mẫu giống có thời gian sinh trưởng dài (121-130 ngày). 3.1.3. Một số đặc điểm hình thái lá và cấu trúc cây Nghiên cứu về một số đặc điểm hình thái lá và cấu trúc cây nhận thấy: 21 mẫu giống lá có màu xanh nhạt, 155 mẫu lá màu xanh và 54 mẫu có màu xanh đậm, 217 mẫu giống có dạng lá kép lông chim, trong đó 4 mẫu giống cà chua là Ru1, Ru2, Ru13 và Ru14 có dạng lá kép lông chim với bề mặt lá nhỏ, lá sẻ thùy nhiều, lá ngắn và 13 mẫu giống có lá dạng như lá khoai tây. Về chiều cao từ gốc đến chùm hoa thứ nhất cho thấy các mẫu giống thuộc nhóm sinh
15. 13 trưởng HH và BHH có chiều cao từ gốc đến chùm hoa thứ nhất dao động từ 22,3 - 49,0 cm, các mẫu giống thuộc nhóm vô hạn dao động trong khoảng 35,3 - 62,5 cm. Quan sát về số đốt từ gốc đến chùm hoa đầu của 230 mẫu giống cho thấy: Nhóm BHH có số đốt đến chùm hoa 1 dao động từ 6,5 - 11,5 đốt, nhóm HH dao động từ 6,0 -9,9 đốt, nhóm VH dao động từ 8,9 đến 13,6 đốt. Kết quả đánh giá chiều cao thân chính của 230 mẫu giống cho thấy nhóm mẫu giống có kiểu sinh trưởng bán hữu hạn có chiều cao thân chính dao động từ 76 - 131,5 cm, nhóm mẫu giống có kiểu sinh trưởng hữu hạn có chiều cao thân dao động từ 54 - 65,9 cm. 3.1.4. Một số đặc điểm hình thái, cấu trúc hoa và đặc điểm nở hoa Nghiên cứu về một số đặc điểm hình thái, cấu trúc hoa và đặc điểm nở hoa nhận thấy: Về cấu trúc chùm hoa, đối chứng C155 và 135 mẫu giống có dạng chùm hoa đơn giản, 23 mẫu giống có dạng chùm phức tạp, 76 mẫu giống dạng chùm trung gian. Đặc biệt có 6 mẫu giống có dạng chùm hoa vừa đơn giản và vừa phức tạp. Về đặc điểm nở hoa, có 126 mẫu giống nở hoa tập chung và 104 mẫu giống nở hoa rải rác, không đồng bộ. Về số hoa/ chùm cho thấy các mẫu giống nghiên cứu có số hoa dao động từ 3,4 - 17,5 hoa/chùm. Một số mẫu giống có số hoa/ chùm rất cao như: AVRDC164 (17,5 hoa/ chùm) hay Ru09 (16,1 hoa/ chùm). Có thể chia các mẫu giống thành 4 nhóm theo số hoa/chùm. Qua đó nhận thấy có 6 mẫu giống có số hoa/ chùm thấp ( 10 hoa/ chùm). 3.1.5. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất Năng suất là yếu tố quyết định đánh giá một giống tốt. Có nhiều yếu tố cấu thành nên năng suất như: Số hoa/ chùm, số quả/ chùm, tỷ lệ đậu quả, số chùm quả/ cây, khối lượng trung bình quả, số quả/ cây. Theo dõi về số quả/ chùm cho thấy dao động từ 1,3 - 8,8 quả/chùm, có 4 mẫu giống có nhiều quả/chùm nhất, đều có trên 7 quả/chùm là các mẫu giống Is01(7,2 quả/ chùm), AVRDC 164 (7,5 quả/ chùm), Ru02 (7,8 quả/ chùm) và Is13 (8,8 quả/ chùm). Nghiên cứu về tỷ lệ đậu quả cho thấy tỷ lệ đậu quả dao động từ 22,41 - 94,44 %. Có 89 mẫu giống cho tỷ lệ đậu quả thấp dưới 50%, các giống còn lại đều cho tỷ lệ đậu quả từ trên 50 - 86.4%. Theo dõi về số quả/ chùm dao động từ 1,5 - 15,2 chùm. Các mẫu giống có số chùm quả/cây ít do các chùm hoa về sau thường không đậu quả do thời tiết lạnh, một số giống có các chùm hoa về sau bị thoái hóa, do đó số chùm quả/cây thấp. Trong tổng số 230 mẫu giống có 78 mẫu giống có số chùm quả/ cây thấp (< 6 chùm quả), 134 mẫu giống có số chùm quả/ cây trung bình (6-10 chùm/ quả) và 18 mẫu giống có trên 10 chùm quả/ cây.
16. 14 Theo dõi về tổng số quả/ cây: Kết quả nghiên cứu các mẫu giống cho thấy số quả/cây dao động từ 5,3 - 92,7 quả. Trong tổng số 230 mẫu giống nghiên cứu có 17 mẫu giống thuộc nhóm ít quả, 38 mẫu giống thuộc nhóm trung bình và 175 mẫu giống còn lại thuộc nhóm sai quả. Kết quả nghiên cứu về khối lượng quả cho thấy khối lượng quả dao động từ 17,4 - 211 g/quả. Dựa vào khối lượng quả, một số tác giả chia cà chua thành 3 nhóm: Nhóm quả nhỏ 100g 5, 20. Theo đó, nhóm quả nhỏ có 69 mẫu giống, nhóm trung bình có 139 mẫu giống và nhóm quả to gồm 22 mẫu giống còn lại. Về năng suất cá thể: Qua nghiên cứu nhận thấy có 13 mẫu giống cho khối lượng trên 2.000 g/ cây, 197 mẫu giống cho khối lượng từ 1000 đến 2000 g/ cây và 20 mẫu giống cho khối lượng quả nhỏ hơn 1000 g/ cây. Một số mẫu giống cho năng suất cao trên 2.000 g gồm các mẫu giống: Cà chua Hồng, H1, H2, H3, H5, H6, H8, H9, H10, H12, H13, H14 và Cn08. Về năng suất thực thu: Qua kết quả nghiên cứu nhận thấy năng suất thực thu của các mẫu giống dao động trong khoảng 15,24 tấn đến 65,2 tấn/ ha. Mẫu giống đạt năng suất thực thu cao nhất là mẫu giống Dòng H6, đạt 62,5 tấn/ ha. Qua theo dõi chúng tôi cũng nhận thấy những mẫu giống có năng suất cá thể cao thì đều cho năng suất thực thu cao như các dòng: H1, H2, H3, H5, H6, H8, H9, H10, H12, H13, H14 và Cn08. Các mẫu giống này năng suất đều đạt trên 55 tấn/ ha. Những mẫu giống cho năng suất cao sẽ là nguồn gen để lai tạo từ đó tạo ra các giống mới năng suất cao. 3.1.6. Một số đặc điểm hình thái, chất lượng quả Đặc điểm vai quả: Đánh giá 230 mẫu giống về màu sắc vai quả xanh cho thấy có 73 mẫu giống có màu sắc vai quả không đổi so với màu sắc phần đáy quả, 91 mẫu giống có vai quả xanh và 66 mẫu giống có vai quả xanh đậm. Màu sắc khi quả chín hoàn toàn: Đánh giá màu sắc quả khi chín hoàn toàn cho thấy 79 mẫu giống quả chín đỏ thẫm, 124 mẫu giống đỏ tươi và 27 đỏ vàng. Hình dạng quả: Qua nghiên cứu nhận thấy có 15 mẫu giống thuộc nhóm quả dẹt, 105 mẫu giống thuộc nhóm quả tròn dẹt, 76 mẫu quả tròn, 24 mẫu giống quả tròn dài và 10 mẫu giống thuộc nhóm quả dài. Độ dày thịt quả: Độ dày thịt quả ngoài việc tăng giá trị sử dụng, tăng khối lượng quả còn là yếu tố xác định độ chắc của quả, giúp cho quá trình vận chuyển và bảo quả tốt hơn. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy có 26 mẫu giống có thịt quả mỏng 4 ngăn hạt.
17. 15 Như vậy, qua kết quả đánh giá 230 mẫu giống trong vụ đông đã xác định được 13 mẫu giống triển vọng có hình dạng quả tròn đến tròn dài (1,0 ≤ I ≤ 1,3), số ngăn hạt từ 2-5 ngăn, cùi quả dày > 0,7 cm, màu quả chín đỏ thẫm hoặc đỏ, quả to trung bình trên 70 g, năng suất cá thể đạt khoảng trên 2000 g/cây trở lên, năng suất thực thu đạt trên 55 tấn/ ha (Bảng 3.5) Bảng 3.5. Một số đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống tốt được sàng lọc từ 230 mẫu giống trong điều kiện vụ Đông 3.2. Phát hiện gen kháng bệnh xoăn vàng lá và gen bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử 3.2.1. Phát hiện gen kháng bệnh xoăn vàng lá 3.2.1.1. Phát hiện gen kháng bệnh xoăn vàng lá Ty1 Chỉ thị CAPS TG97 được sử dụng để phát hiện gen kháng Ty1. Sản phẩm PCR với cặp mồi TG97F/R là một đoạn ADN dài khoảng 400 bp ở tất cả các mẫu giống nghiên cứu. Sau khi cắt sản phẩm bằng enzyme TaqI, các mẫu giống mang gen Ty1 xuất hiện 2 vạch băng dài khoảng 300bp và 100 bp 60. Phát hiện gen kháng Ty1 ở 230 mẫu giống nhận thấy có 11 mẫu giống chứa gen, là các mẫu giống AVRDC139, AVRDC154, AVRDC188, AVRDC189, AVRDC193, AVRDC198, Fr28, Fr34, Is23, Is34 và Ru07.
18. 16 3.2.1.2. Phát hiện gen kháng xoăn vàng lá Ty2 Chỉ thị SCAR T0302 được sử dụng để phát hiện gen Ty2. Sản phẩm PCR với cặp mồi T0302F/TY2R1 khi điện di nếu xuất hiện vệt băng kích thước 600bp là những mẫu giống mang gen Ty2 53. Qua đó, phát hiện được 5 mẫu giống trên tổng 230 mẫu giống chứa gen kháng bệnh xoăn vàng lá Ty2, là các mẫu giống AVRDC135, AVRDC138, AVRDC139, AVRDC142 và AVRDC144. 3.2.1.3. Phát hiện gen kháng Ty3 Chỉ thị P6-25 được sử dụng để phát hiện gen kháng Ty3. Cặp mồi P6-25 F/R khuếch đại tạo ra sản phẩm là một băng 660bp đối với alen Ty3b và một băng 630bp với alen Ty3a, alen mẫn cảm ty3 cho một băng 320bp. Sử dụng chỉ thị SCAR P6-25 với cặp mồi P6-25F/R để phát hiện kháng Ty3 ở 230 mẫu giống cà chua, đã phát hiện được 8 mẫu giống chứa gen này là: AVRDC154, AVRDC165, AVRDC166, AVRDC192, AVRDC195, Is11, Is12 và Is22. 3.2.1.4. Phát hiện gen kháng Ty4 Trong nghiên cứu này sử dụng chỉ thị C2_AT5g51110 để phát hiện gen Ty4. Những mẫu giống chứa gen Ty4 thì vệt băng có kích thước khoảng 325 bp, còn không chứa gen thì không có sản phẩm PCR được nhân lên. Qua đó đã phát hiện được 4 mẫu giống chứa gen Ty4 là AVRDC102, AVRDC115, AVRDC122 và AVRDC123. 3.2.1.5. Phát hiện gen kháng ty5 Sử dụng cặp mồi nhân chỉ thị TM719 bằng PCR phát hiện gen ty5. Kết quả phát hiện phát hiện được 6 mẫu giống chứa gen kháng ty5 là Is4 và Is5, Fr13, AVRDC139, AVRDC140 và AVRDC151. Như vậy, bằng chỉ thị phân tử DNA đã phát hiện được 11 mẫu giống chứa gen Ty1, 5 mẫu giống chứa gen Ty2, 8 mẫu giống chứa gen Ty3, 4 mẫu giống chứa gen Ty4 và 6 mẫu giống chứa gen ty5. Đặc biệt có những mẫu giống chứa 02 gen kháng và 03 gen kháng là AVRDC154 chứa gen Ty1 và Ty3 và AVRDC139 chứa gen Ty1, Ty2 và ty5. 3.2.2. Phát hiện gen kháng bệnh mốc sương 3.2.2.1. Phát hiện gen kháng Ph2 Trong nghiên cứu này chỉ thị UF-Ph2-1 đã được lựa chọn để phát hiện gen Ph2. Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi nhân chỉ thị UF-Ph2-1 có kích thước khoảng 500 bp ở cả những mẫu giống kháng và nhiễm. Sử dụng enzyme cắt giới hạn Hinf I cắt sản phẩm PCR trên mới có thể phân biệt được các trạng thái của các alen. Nếu là alen kháng (dạng đồng hợp tử trội) xuất hiện 3 vạch băng kích thước 355, 125 và 27 bp. Điều tra 230 mẫu giống bằng chỉ thị UF-Ph2-1 phát hiện được được 11 mẫu giống mang gen kháng Ph2, là các mẫu giống: AVRDC113, AVRDC114, AVRDC150, AVRDC181; AVRDC182; Us03, Us12; Us13; Fr20 và Fr23.
19. 17 3.2.2.2. Phát hiện gen kháng Ph3 Để phát hiện gen kháng bệnh mốc sương Ph3, trong nghiên cứu này chỉ thị SCU602 đã được sử dụng. Cặp mồi SCU602F3/R3 nhân chỉ thị SCU602, với alen kháng sản phẩm PCR có kích thước 400 bp. Trong tổng số 230 mẫu giống được điều tra, 17 mẫu được phát hiện là mang gen kháng Ph3, là các mẫu: AVRDC124, AVRDC125, AVRDC130, AVRDC131, AVRDC139, AVRDC140, AVRDC152, AVRDC157, AVRDC181, AVRDC182 và AVRDC198; Fr18, Fr23; Fr33; Is04, Is05 và Is14. 3.3. Lây nhiễm nhân tạo xác định gen kháng hữu hiệu 3.3.1. Xác định gen kháng bệnh xoăn vàng lá hữu hiệu Bốn nguồn gây bệnh xoăn vàng lá được thu thập tại Hải phòng, Hưng Yên, Bắc Giang và cấu trúc xâm nhiễm ToLCHnV dùng để lây nhiễm nhân tạo Từ kết quả lây nhiễm nhận thấy rằng các mẫu giống mang gen Ty1 và Ty3 có khả năng kháng tốt nhất đối với tất cả các nguồn bệnh. Đặc biệt mẫu giống chứa đồng thời hai gen Ty1 và Ty3 hoặc 3 gen Ty1, Ty2 và ty5 thì kháng hoàn toàn với tất cả các nguồn bệnh lây nhiễm. 3.3.2. Xác định gen kháng bệnh mốc sương hữu hiệu Đánh giá khả năng kháng bệnh của của hai gen Ph2 và Ph3 bằng lây nhiễm nhân tạo 6 isolate nấm bệnh mốc sương theo phương pháp của Nelson và Trương Văn Dư. Kết quả lây nhiễm cho thấy tất cả các mẫu giống mang gen Ph2 kháng cao (HR) đối với isolate thu thập tại Thái Bình và Hải Phòng và kháng (R) với isolate thu thập tại Hải Dương. Nhiễm (S) đối với isolate thu thập tại Hà Nội, Sơn La và Thanh Hoá. Các mẫu giống mang gen Ph3 kháng cao (HR) đối với isolate thu thập tại Sơn La và Thanh Hoá, kháng (R) đối với 3 isolate thu thập tại Hà Nội, Thái Bình, Hải Phòng và nhiễm với isolate thu thập tại Hải Dương. Như vậy gen Ph3 có khả năng kháng tốt hơn gen Ph2. Mẫu giống mang hai gen kháng Ph2 và Ph3 kháng được tất cả các isolate bệnh mốc sương 3.4. Lai, chọn tạo giống mới 3.4.1. Lai giữa mẫu giống cà chua chứa gen với các mẫu giống tốt Từ các mẫu giống tốt và các mẫu giống mang gen kháng Ty1, Ty3, Ph2 và Ph3 được lai với nhau. Qua đó, 271 tổ hợp lai đã được lai tạo, trong đó 135 tổ hợp lai giữa mẫu giống tốt với mẫu giống mang gen kháng Ty1 và Ty3 và 136 tổ hợp lai giữa mẫu giống tốt với mẫu giống mang gen kháng Ph2 và Ph3. Đánh giá 135 tổ hợp lai F1 chứa gen kháng bệnh xoăn vàng lá chọn ra 19 tổ hợp lai tốt. Trong đó có 8 tổ hợp lai có bố mang gen kháng Ty1, 08 tổ hợp lai có bố mang gen kháng Ty3 và 03 tổ hợp lai có bố mang đồng thời hai gen kháng Ty1 và Ty3. Đánh giá136 tổ hợp lai F1 chứa gen kháng bệnh mốc sương chọn ra 29 tổ hợp lai tốt, cho ưu thế lai cao. Trong đó có 19 tổ hợp lai có bố mang gen kháng
20. 18 Ph3, 02 tổ hợp lai có bố mang gen kháng Ph2 và 08 tổ hợp lai có bố mang đồng thời hai gen kháng Ph2 và Ph3 (bảng 3.11a và 3.11b). Để chắc chắn rằng các tổ hợp lai được chọn đều là lai thật (đúng bố mẹ như đã định) chỉ thị phân tử ADN được áp dụng vào để kiểm tra con lai F1. Các tổ hợp chứa gen kháng Ty1, Ty3, Ph2 và Ph3 được kiểm tra lần lượt bằng chỉ thị TG97, P6-25, UF-Ph2-1 và SCU60. Kết quả kiểm tra cho thấy 100% các tổ hợp lai F1 đều là lai thật. Bảng 3.11a. Danh sách 19 tổ hợp lai F1 tốt, cho ưu thế lai cao và được kiểm tra gen kháng bệnh xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử ADN
21. 19 Bảng 3.11b. Danh sách 29 tổ hợp lai F1 tốt, cho ưu thế lai cao và được kiểm tra gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử ADN 3.4.2. Chọn lọc các cá thể trong quần thể F2 mang gen kháng đồng hợp tử 3.4.2.1. Chọn lọc các thể mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá Ty1 và Ty3 Trong quần thể F2, chỉ thị TG97 tiếp tục được sử dụng để chọn lọc gen kháng Ty1 đồng hợp tử trội và chỉ thị P6-25 chọn lọc gen kháng Ty3 đồng hợp trội. Khoảng 50 cá thể F2 tốt nhất của mỗi tổ hợp được cắm thẻ để xác đinh kiểu gen kháng đồng hợp tử. Từ 19 quần thể F2, 59 cá thể mang
22. 20 kháng Ty1 đồng hợp tử, 49 cá thể mang gen kháng Ty3 đồng hợp tử và 3 cá thể mang đồng thời hai gen kháng Ty1 và Ty3 đã được chọn. 3.4.2.2. Chọn lọc các thể mang gen kháng bệnh mốc sương Ph2 và Ph3 Trong quần thể F2 của 29 tổ hợp, sử dụng chỉ thị UF-Ph2-1 để chọn lọc gen kháng Ph2 đồng hợp tử trội và chỉ thị SCU60 để chọn lọc gen kháng Ph3 đồng hợp trội. Kết quả 65 cá thể mang kháng Ph2 đồng hợp tử, 175 cá thể mang gen kháng Ph3 đồng hợp tử và 7 cá thể mang đồng thời hai gen kháng đã được chọn. Các cá thể F2 được hỗn và cho tự thụ liên tục ở nhiều thế hệ, sau đó tách dòng ở thế hệ F6. 3.4.3. Tách dòng Trên cơ sở các quần thể F6, mỗi quần thể đều được lựa chọn cá thể tốt nhất đạt năng suất cao, tối thiểu năng suất cá thể đạt từ 1,5 kg trở nên. Qua đó, 20 dòng mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá Ty1 và Ty3 và 24 dòng mang gen gen kháng bệnh mốc sương Ph2 và Ph3 đã được chọn. Nguồn gốc và đặc điểm của các dòng chọn lọc được mô tả ở bảng 3.14a và 3.14b. Bảng 3.14a. Nguồn gốc và đặc điểm của 20 dòng cà chua thế hệ F6 mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá Ty1 và Ty3
23. 21 Bảng 3.14b. Nguồn gốc và đặc điểm của 24 dòng cà chua thế hệ F6 mang gen kháng bệnh mốc sương Ph2 và Ph3 Để chắc chắn các gen Ty1, Ty3, Ph2 và Ph3 đã được cố định trong các dòng được chọn, chỉ thị phân tử DNA tiếp tục được ứng dụng để kiểm tra. Các dòng chọn lọc mang gen kháng Ty1, Ty3, Ph2 và Ph3 được kiểm tra lần lượt bằng các chỉ thị TG97, P6-25, UF-Ph2-1 và SCU60. Kết quả kiểm tra cho thấy cho thấy 100% các dòng chọn lọc đều mang các gen kháng bệnh mục tiêu. 3.4.4. Đánh giá và so sánh các dòng chọn lọc Đến thế hệ F6, 44 dòng cà chua tốt đã được chọn lọc, trong đó 20 dòng cà chua mang các gen bệnh xoăn vàng lá Ty1, Ty3 và 24 dòng mang gen kháng bệnh mốc sương Ph2 và Ph3. Để chọn ra dòng ưu tú nhất vừa có khả năng kháng bệnh vừa cho năng suất cao để tiến hành so sánh, khảo nghiệm, các dòng chọn lọc được đánh giá trong điều kiện vụ đông năm 2018.
24. 22 Qua đánh giá đặc điểm nông sinh học, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất, 9 dòng ưu tú đã được chọn. Chúng có kiểu hình đẹp và đặc biệt là cho năng suất cao hơn hẳn đối chứng C155. Trong số đó 5 dòng mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá là các dòng TP48-1; TP88, TP90, TP130, P135 và 4 dòng mang gen kháng bệnh mốc sương là P1, P7, P15 và P24. Đặc điểm của các dòng được tổng hợp ở bảng 3.16. Bảng 3.16. Đặc điểm của 9 đòng cà chua ưu tú 3.4.5. Khảo nghiệm các dòng cà chua ưu tú 3.4.5.1. Khảo nghiệm cơ bản các dòng cà chua ưu tú Khảo nghiệm cơ bản được tiến hành tại Gia Lâm Hà Nội trong hai vụ, vụ Xuân hè và vụ Đông năm 2019 nhằm đánh giá khả năng thích ứng của các dòng cà chua ưu tú nói trên ở miền Bắc Việt Nam. Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm khả năng sinh trưởng, phát triển, đặc điểm hình thái, khả năng chống chịu sâu bệnh, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất, các chỉ tiêu về chất lượng. Trong cả hai vụ khảo nghiệm cơ bản nhận thấy các dòng ưu tú đều thể hiện tính vượt trội so với đối chứng C155, đặc biệt có 3 dòng cho luôn cho năng suất cao hơn đối chứng C155 là các TP130, TP135, P7. Bên cạnh đánh giá và các đặc điểm nông sinh học và năng suất, chúng tôi còn đánh giá khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương trên đồng ruộng và bằng lây nhiễm nhân tạo. Kết quả cho thấy các dòng mang gen kháng bệnh Ty1 và Ty3 kháng tốt với bệnh xoăn lá cả ở trên đồng ruộng và lây nhiễm nhân tạo. Các dòng mang gen kháng Ph2 hoặc Ph3 thì cũng thể hiện tính kháng rất tốt. Trên đồng ruộng hầu như không có triệu chứng và bằng lây nhiễm nhân tạo cũng cho kết quả tương tự như các mẫu mang gen kháng được đánh giá trước đó.
25. 23 3.4.5.2. Khảo nghiệm sinh thái các dòng cà chua ưu tú Để đánh giá khả năng thích ứng của 9 dòng cà chua ưu tú đã khảo nghiệm cơ bản ở trên chúng tôi tiếp tục trồng khảo nghiệm sinh thái tại 3 vùng là Mộc Châu - Sơn La, Sóc Sơn - Hà Nội và Vĩnh Bảo - Hải Phòng, đây là những vùng sản xuất cà chua nhiều. Khảo nghiệm trong 3 vụ gồm: Vụ Đông 2019, vụ Xuân hè 2020 và vụ Đông 2020, vụ xuân gieo hạt 20/1 và vụ Đông gieo hạt 10/9. Riêng ở Sơn La, vụ Đông gieo hạt sớm hơn hai điểm còn lại 1 tháng. Qua khảo nghiệm 3 vụ liên tiếp tại 3 điểm khảo nghiệm, ba dòng cho năng suất cao và ổn định đã được chọn, đó là các dòng TP130 (mang gen kháng Ty1), TP130 (mang gen kháng Ty3) và P7 (mang gen kháng Ph3). Các dòng này đều cho năng suất cao hơn đối chứng C155 ở tất cả các vụ và ở tất cả các điểm. Ngoài cho năng suất cao chúng còn có khả năng kháng bệnh tốt. Các dòng kháng tốt với bệnh xoăn vàng lá cà chua là TP130 mang gen Ty1 và TP135 mang gen Ty3. Dòng P7 kháng tốt với bệnh mốc sương mang gen Ph3. Các dòng này cần được công nhận giống để phát triển trong thực tiễn mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người nông dân và doanh nghiệp. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1) Đánh giá được 230 mẫu giống cà chua về các đặc điểm nông sinh học như: kiểu hình sinh trưởng, các giai đoạn sinh trưởng, các đặc điểm hình thái lá và cấu trúc cây, cấu trúc hoa, đặc điểm nở hoa, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất, một số đặc điểm hình thái chất lượng quả. Qua đó chọn được 13 mẫu giống có kiểu hình đẹp, cho năng suất cao trên 2,0 kg/ cây làm nguồn vật liệu cho lai tạo giống mới. 2) Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện các gen kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương của 230 mẫu giống cà chua. Phát hiện được 11 mẫu giống mang gen Ty1, 5 mẫu giống mang gen Ty2, 8 mẫu giống mang gen Ty3, 4 mẫu giống mang gen Ty4, 6 mẫu giống mang gen ty5, 11 mẫu giống mang gen Ph2 và 17 mẫu giống mang gen Ph3. Đặc biệt có 02 mẫu giống AVRDC139 và AVRDC 140 mang đồng thời hai gen kháng Ty và Ph. Các mẫu giống này là nguồn vật liệu vô cùng quý giá trong chương trình chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương. 3) Lây nhiễm nhân tạo 04 nguồn bệnh xoăn vàng lá trên các mẫu giống mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá và 06 isolate bệnh mốc sương trên các mẫu giống mang gen kháng bệnh mốc sương. Xác định được 02 gen kháng hữu hiệu với các nguồn bệnh xoăn vàng lá của miền Bắc Việt Nam là Ty1 và Ty3 và gen kháng Ph2 và Ph3 kháng tốt với bệnh mốc sương, tuy nhiêu gen Ph3 kháng tốt hơn Ph2.
26. 24 4) Lai 13 mẫu giống tốt với các mẫu giống mang gen kháng bệnh xoăn vàng lá Ty1 và Ty3 và gen kháng bệnh mốc sương Ph2 và Ph3. Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để chọn lọc các cá thể mang gen kháng bệnh đồng hợp tử từ thế hệ phân ly F2. Duy trì, chọn lọc, khảo nghiệm cơ bản và khảo nghiệm sinh thái đã chọn được 3 dòng cà chua tốt nhất cho năng suất cao, kháng bệnh xoăn vàng lá và bênh mốc sương. Các dòng tốt được chọn tạo là dòng TP130 mang gen Ty1, TP135 mang gen Ty3 và P7 mang gen kháng Ph3 cho năng suất ổn định và đạt năng suất trên 50 tấn/ ha trong vụ Xuân hè, trên 60 tấn/ha trong vụ Đông, cao hơn giống đối chứng C155 qua các vụ và các vùng sinh thái nhau. 2. Đề nghị 1) Tiếp tục sử dụng nguồn gen được đánh giá, đặc biệt là các mẫu giống tốt, cho năng suất cao và các mẫu giống chứa gen kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương nhằm tạo ra các giống mới kháng đồng thời cả hai bệnh xoăn vàng lá và mốc sương cho các tỉnh phía Bắc. 2) Tiếp tục đánh giá và mở rộng sản xuất giống các dòng cà chua tốt, cho năng suất cao, kháng bệnh xoăn vàng lá và bệnh mốc sương là TP130, TP135 và P7 nhằm đem lại lợi ích kinh tế cho người nông dân và doanh nghiệp. 3) Tiếp tục nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật canh tác cho các dòng thuần ở trên, nhằm khai thác hết tiềm năng của chúng để đem lại đạt hiệu quả kinh tế cao nhất cho người sản xuất và doanh nghiệp.
27. 25 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Tống Văn Hải, Phan Thị Hiền, Trịnh Thị Thu Thủy, Phan Hữu Tôn, Nguyễn Quốc Trung (2020), Phát hiện gen kháng bệnh xoăn vàng lá cà chua hữu hiệu bằng chỉ thị phân tử DNA và lây nhiễm nhân tạo, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2020, tr.607-613 2. Tống Văn Hải, Phan Hữu Tôn, Phan Thị Hiền, Nguyễn Quốc Trung (2021), Chọn tạo giống cà chua thuần kháng bệnh xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA, Tạp chí khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Số 19 (3), tr.399-409. 3. Tống Văn Hải, Phan Hữu Tôn, Phan Thị Hiền, Nguyễn Quốc Trung, Trịnh Thị Thu Thủy (2021), Phát hiện gen kháng bệnh mốc sương cà chua bằng chỉ thị phân tử và đánh giá khả năng kháng của các gen bằng lây nhiễm nhân tạo, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2021, tr.740-746.