Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh..

Nội dung tài liệu: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 62420201 TRẦN VŨ PHƯƠNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SỢI (ACTINOBACTERIA) TỪ HẢI MIÊN VÙNG BIỂN HÀ TIÊN VÀ XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT SINH HỌC KHÁNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH Cần Thơ, 2022
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: GS.TS. Cao Ngọc Điệp Người hướng dẫn phụ: PGS.TS. Ngô Thị Phương Dung Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường Họp tại: Phòng Bảo Vệ Luận Án Tiến Sĩ, Lầu 2 - Nhà Điều Hành, Trường Đại Học Cần Thơ. Vào lúc giờ ngày tháng năm 2022 Phản biện 1: Phản biện 2: Xác nhận đã xem lại của chủ tịch Hội đồng Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Tạp chí quốc tế 1 Tran Vu Phuong, Phan Van Ha Lam, and Cao Ngoc Diep, (2018). Bioactive compounds from Marine Streptomyces sp. by Gas Chromatography-Mass Spectrometry. The Pharmaceutical and Chemical Journal, Volume 5, Issue 1, pp. 196-203. 2 Tran Vu Phuong, Ngo Thi Phuong Dung, Cao Ngoc Diep, (2019). Diversified collection of novel sponge-associated actinobacteria of Ha Tien sea, Kien Giang province, Vietnam. International Journal of Innovations in Engineering and Technology (IJIET), Volume 14, Issue 2, pp. 33-41. 3 Tran Vu Phuong and Cao Ngoc Diep, (2021). Sponge- associated actinobacteria Kien Giang sea exhibiting antimicrobial activity against human pathogenic Salmonella typhimurium. International Journal of Innovations in Engineering and Technology (IJIET), Volume 19, Issue 4, pp. 33-41. 4 Tran Vu Phuong and Cao Ngoc Diep, 2021. Screening of Sponge-associated Actinobacteria against Human Pathogenic Candida albicans in Kien Giang Sea, Vietnam. International Journal of Environmental & Agriculture Research (IJOEAR), Volume 7, Issue 7, pp. 21-26. 5 Tran Vu Phuong and Cao Ngoc Diep, 2021. Testing the ability against Bacillus cereus of actinobacteria strains isolated from sponges in Kien Giang Sea, Vietnam. International Journal of Environmental & Agriculture Research (IJOEAR), Volume 19, Issue 9, pp. 37-42.
4. 6 Tran Vu Phuong and Cao Ngoc Diep, 2021. Bioactive Compounds from Marine Microbacterium tumbae ND2.7c Strain by Gas Chromatography-Mass Spectrometry. The Pharmaceutical and Chemical Journal, Volume 8, Issue 5, pp. 12-18. Tạp chí trong nước 1 Tran Vu Phuong, Phan Van Ha Lam, Duong Xuan Chu, and Cao Ngoc Diep, (2018). Secondary Metabolite Produced from Marine Bacterium Streptomyces sp. strain ND7c. Can Tho University Journal of Science, Volume 54, Issue 5, pp. 88-90. 2 Trần Vũ Phương, Phạm Ngọc Hân và Cao Ngọc Điệp, (2019). Phân lập vi khuẩn liên kết với hải miên ở Hòn Nghệ, vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang, Việt Nam. Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần thơ, Tập 55, Chuên đề công nghệ sinh học 2019(2), tr. 1-9.
5. CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu Vi sinh vật là nguyên nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho người và động vật. Tuy nhiên, có một vấn đề ngày càng phổ biến, đó là sự xuất hiện của các vi sinh vật kháng kháng sinh. Do đó, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất chất kháng sinh là cải tiến các chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, đồng thời thúc đẩy nghiên cứu để tìm ra các chất kháng sinh mới (Alanis, 2005). Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh thì vi khuẩn sợi (actinobacteria) hay còn gọi là xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, khoảng 80% các chất kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ vi khuẩn sợi, đặt biệt là các loài thuộc chi Streptomyces (Aslan, 1999). Tuy nhiên, việc tìm ra kháng sinh mới từ Streptomyces phân lập từ đất ngày càng trở nên hiếm và khó khăn, do vậy, việc phân lập các loài vi khuẩn sợi từ các nguồn đặc biệt khác để tìm kiếm kháng sinh mới là rất cần thiết (Sirisha et al., 2013). Trong xu hướng này, các loài vi khuẩn sợi hiếm phân lập từ biển được quan tâm nhiều hơn do khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như kháng sinh, hợp chất kháng ung thư, kháng khối u, thuốc bảo vệ thực vật Trong đó, nhóm vi khuẩn sợi cộng sinh với hải miên được nhiều nhà khoa học quan tâm (Asha Devi et al., 2006). Vùng biển Hà Tiên có nguồn nước biển sạch, trong, nông và ấm nên có nhiều loài sinh vật sống rất phong phú trong đó có nhiều loài hải miên. Hải miên là nguồn chứa nhiều vi sinh vật cộng sinh, trong đ1o có vi khuẩn sợi có khả năng sản xuất chất có hoạt tính sinh học, góp phần mang lại lợi ích về những kháng sinh mới phục vụ cho y học, tuy nhiên công trình nghiên cứu về nhóm vi khuẩn sợi này hiện còn khá hạn chế. Từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) từ hải miên vùng biển Hà Tiên và xác định hợp chất sinh học kháng vi sinh vật gây bệnh” được tiến hành nhằm góp phần làm phong phú các sản phẩm có giá trị cao khai thác từ 1
6. nguồn tài nguyên biển phục vụ cho cuộc sống và có thể ứng dụng trong y học. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn được những dòng vi khuẩn sợi có khả năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao, đồng thời xác định được các hợp chất có hoạt tính sinh học, tạo nguồn vật liệu phục vụ cho nghiên cứu sản xuất các hợp chất ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm. 1.3 Nội dung nghiên cứu Luận án có 5 nội dung nghiên cứu chính bao gồm: (1) Phân lập vi khuẩn sợi từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên; (2) Đánh giá và tuyển chọn các dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng với vi sinh vật gây bệnh thử nghiệm gồm Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli và Candida albicans, và có khả năng sản xuất hợp chất sinh học có hoạt tính kháng khuẩn cao; (3) Nhận diện và khảo sát mối liên hệ di truyền các dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử; (4) Khảo sát sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS chỉ thị cho sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học của các dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn; (5) Xác định hợp chất có hoạt tính sinh học của dòng vi khuẩn sợi tiềm năng nhất. 1.4. Đóng góp mới của luận án Đã phân lập được 198 dòng vi khuẩn sợi từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên, trong đó 130/198 dòng (đạt 65,7%) có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật được thử nghiệm gồm Bacillus cereus (82 dòng, đạt 41,4%), Salmonella typhimurium (73 dòng, đạt 36,9%), Candida albicans (42 dòng, đạt 21,2%), Escherichia coli (39 dòng, đạt 19,7%) và Staphylococcus aureus (22 dòng, đạt 11,4%) Đã tuyển chọn và định danh được 23 dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng ít nhất hai dòng vi sinh vật chỉ thị trở lên với mức độ kháng từ trung bình đến kháng mạnh. Các dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn thuộc 4 họ bao gồm họ Actinomycetaceae, Microbacteriaceae, Nocardiaceae và Gordoniaceae. Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có 2
7. hoạt tính sinh học được ghi nhận có sự khác nhau, bao gồm PKS-I là 69,6%, PKS-II là 60,9% và NRPS là 47,8%. Hai dòng vi khuẩn sợi tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao đã được định danh là Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c. Bảy hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ Streptomyces tateyamensis ND1.7a đã được xác định, gồm có: thymine; 2-Pentanone-4-hydroxy-4-methyl; cyclohexasiloxane dodecamethyl; cycloheptasiloxane tetradecamethyl; oxime- methoxy- phenyl; hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester và diisooctyl phthalate. Đối với Microbacterium tumbae ND2.7c, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định bao gồm: cyclopentasiloxane decamethyl-, tetrasiloxane 3.5-diethoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl-3,5- bis(trimethylsiloxy), 1-dodecene, 3-isopropoxy-1,1,1,7,7,7-hexamethyl- 3,5,5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane, 3,5-di-t-butylphenol, phthalic acid, 3,4-dihydroxymandelic acid 4TMS, 1.6-dioxacyclododecane-7-12- dione, 2-propyl-1-pentanol, 2-(2’,4’,4’,6’,6’,8’,8’- heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)-2,4,4,6,6,8,8,10.10- nonamethylcyclopentasiloxane và phthalic acid monoethyl ester. Kết quả của đề tài về các hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn, là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các vi sinh vật cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người. 1.5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án Luận án cung cấp thông tin khoa học về các nhóm vi khuẩn sợi sống cộng sinh với hải miên có khả năng sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn. Các kết quả của luận án có thể được sử dụng như là nguồn tài liệu tham khảo trong giảng dạy cũng như cho sinh viên bậc đại học và sau đại học tại cơ sở đào tạo khi nghiên cứu về lĩnh vực này. Các dòng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn cao được phân lập từ hải miên là nguồn vật liệu có thể sử dụng phục vụ cho nghiên cứu tinh sạch, sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học cao góp phần ứng dụng trong việc điều trị bệnh và bảo vệ sức khỏe cho con người. 3
8. CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hải miên (bọt biển, sponges) là những sinh vật biển xuất hiện trên trái đất khá lâu, cách đây hơn 580 triệu năm (Li et al., 1998), sống thành cộng đồng ở nơi nước biển trong, sạch, nông (Watson & Barnes, 2004). Đây là ngành động vật đơn giản và nguyên thủy nhất, có những mô khác nhau nhưng không có cơ, hệ thần kinh, cơ quan bên trong, hay khả năng vận động. Hải miên đã từng được xem là đã tách ra từ các động vật khác trước đây, tuy nhiên, chúng thiếu tổ hợp phức tạp được tìm thấy trong hầu hết các ngành động vật khác. Các tế bào của hải miên khác biệt nhưng trong hầu hết các trường hợp không được tổ chức thành các mô riêng biệt. Động vật thân lỗ thường ăn bằng cách hút nước qua mạng lưới các lỗ trong đó có nhiều vi khuẩn trong nước biển bằng bơm một thể tích nước rất lớn (24 m3/kg/ngày) (Kennedy et al., 2009). Hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô của chúng, sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa. Vacelet & Donadey (1977) đã phát hiện một số vi sinh vật cộng sinh với loài bọt biển này, nhất là vi khuẩn các ngành (phyla) khác nhau được xác định trong hải miên như Proteobacteria, Cyanobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi, Bacteroidetes, Nitrospira và Planctomycetes cùng 1 ngành mới là Poribacteria. Sự tiến hóa và sự cân bằng sinh thái bền vững của hải miên có lẽ một phần do sự cộng sinh của chúng với cộng đồng vi sinh vật. Tuy nhiên, không giống như các vật chủ khác chỉ có một số ít vi sinh vật có khả năng cộng sinh, hải miên có các nhóm vi sinh vật cộng sinh rất đa dạng. Taylor et al., (2007) đã phát hiện có sự liên kết của các loài thuộc ba giới là Vi khuẩn (Bacteria), Cổ vi khuẩn (Archaea) và Vi sinh vật chân hạch hay nhân thật (Eukarya) với hải miên. Các quần thể vi sinh vật khác sống trong hải miên còn có vi nấm và vi tảo, sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa. Vi sinh vật liên kết với hải miên có cả nội bào và ngoại bào (Calcinai et al., 2006; Cho et al., 4
9. 2010). Các vi sinh vật chiếm đến 40% tổng sinh khối của hải miên, hoặc nội bào trong các tế bào hoặc ngoài tế bào trong lớp cấu trúc xốp (Wilkinson et al., 1978). Nhiều tác giả đã phát hiện các nhóm gen polyketide synthase trong vi sinh vật liên đới hải miên bằng những phân tích metagenomics (Piel et al., 2004; Schirmer et al., 2005; Kennedy et al., 2009). Nghiên cứu về hai enzyme Non-ribosome peptide synthetases (NRPS) và I Polyketide synthases (PKS-I) là multimodular enzyme tham gia vào tổng hợp các oligopeptide và các chất chuyển hóa thứ cấp polyketide sản xuất bởi vi sinh vật như vi khuẩn và nấm. Polyketide synthases (PKS) và non ribosomal peptide synthases (NRPS) tham gia vào sản xuất rất nhiều các sản phẩm tự nhiên. NRPS liên quan đến tạo ra một số thuốc chống khối u, ức chế miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus quan trọng nhất hiện nay có và hàng trăm các sản phẩm tự nhiên, gồm hợp chất giảm cholesterol lovastatin là từ PKS. Hải miên có thể cung cấp những thuốc tiềm năng chống lại rất nhiều mầm bệnh trên thế giới, các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm. Trong số 18.000 sản phẩm tự nhiên từ biển được mô tả, hơn 30% là từ hải miên (Koopmans et al., 2009). Nghiên cứu về vi sinh vật cộng sinh với hải miên, Cường et al. (2014) đã sàng lọc được 41 dòng vi khuẩn và 11 dòng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng từ hải miên thu tại biển vùng biển Hải vân - Sơn Chà, trong đó có 9 dòng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng 3 nguồn vi khuẩn gây bệnh trở lên và 1 dòng xạ khuẩn LC19b4 có khả năng ức chế sinh trưởng của cả 3 nguồn vi khuẩn gây bệnh với đường kính kháng khuẩn từ 14-17,5 mm. Các nghiên cứu về vi sinh vật liên kết với hải miên tại Việt Nam còn hạn chế và có rất ít nghiên cứu về tính đối kháng của hệ vi sinh vật này với các dòng vi sinh vật gây bệnh, cũng như phát hiện các chất có hoạt tính sinh học khác từ hệ vi sinh vật này. 5
10. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên vật liệu Mẫu hải miên được thu tại: Hòn Kiến Vàng, Hòn Rễ Lớn, Hòn Rễ Nhỏ, Ba Hòn Đầm, Hòn Nghệ, Hòn Heo, Bãi Núi Đèn thuộc vùng biển Hà Tiên ở độ sâu 0,5 - 1 m so với mực nước biển. Các dòng vi sinh vật thử nghiệm gồm: Bacillus cereus ATCC 11778; Candida albicans ATCC 10231; Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella typhimurium ATCC 14028; Staphylococcus aureus ATCC 25923. 3.2. Phân lập vi khuẩn sợi Mẫu hải miên được cắt thành từng ô nhỏ có kích thước khoảng 1 cm3, rửa với nước biển tiệt trùng 3 lần, thêm vào 3 mL nước biển vô trùng, nghiền nát mẫu. Pha loãng nồng độ dung dịch mẫu lần lượt 10-1, 10-3, 10-6 lần. Chủng 100 µL dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng cho vào các đĩa môi trường nuôi cấy (SCA), ủ ở 30oC. Các khuẩn lạc xuất hiện được cấy sang đĩa môi trường theo cách cấy phân lập cho đến khi ròng. Quan sát, ghi nhận các đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào của cá dòng vi khuẩn sợi phân lập được. 3.3. Đánh giá khả năng kháng khuẩn Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi đối với vi sinh vật thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch theo phương pháp của Bauer (1966). Tuyển chọn dòng vi khuẩn sợi tiềm năng thông qua đường kính vòng kháng khuẩn, và khả năng kháng được nhiều dòng vi khuẩn gây bệnh. Số liệu kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics và Microsoft excel 2010. 3.4. Nhận diện vi khuẩn sợi bằng phương pháp sinh học phân tử Giải trình tự đoạn gen của các dòng vi khuẩn sợi có hoạt tính kháng khuẩn cao được tuyển chọn với cặp mồi SC-Act-0235-aS-20: 5’- CGCGGCCTATCAGCTTGTTG-3’ và SC-Act-0878-aA-19: 5’- CCGTACTCCCCAGGCGGGG- 3’ chuyên biệt cho vi khuẩn sợi (Stach et al., 2003). Thông qua trình tự đoạn gen, so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI, kết hợp với các đặc điểm hình 6
11. thái khuẩn lạc, các đặc điểm về hình thái tế bào, đặc điểm sinh học của tế bào, định danh được tên của các dòng vi khuẩn sợi được tuyển chọn và khảo sát mối liên hệ di truyền của các dòng vi khuẩn sợi được tuyển chọn bằng phần mềm CLUSTALX, version 1.8 và phần mềm Mega 7.0 với hệ số bootstrapping 1000 lần. 3.5. Khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, và NRPS Khảo sát sự hiện diện của các gen polyketide synthase type I (PKS-I), polyketide synthase type II (PKS-II) và gen nonribosomal peptide synthetase (NRPS) bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi chuyên biệt A3F/A7R cho gen NPRS, K1F/M6R cho gen PKS-I và cặp mồi KSαF/KSαR cho gen PKS-II. Gen PKS-I: Ghi nhận có sự xuất hiện (+) của gen PKS-I khi kết quả điện di sản phẩm PCR xuất hiện band ở vị trí có kích thước khoảng 1.200 - 1400 bp. Ghi nhận (-) khi không xuất hiện band ở vị trí nêu trên. Gen PKS-II: Ghi nhận có sự xuất hiện (+) của gen PKS-II khi kết quả điện di sản phẩm PCR xuất hiện band ở vị trí có kích thước khoảng 600 bp. Ghi nhận (-) khi không xuất hiện band ở vị trí nêu trên. Gen NRPS: Ghi nhận có sự xuất hiện (+) của gen NRPS khi kết quả điện di sản phẩm PCR xuất hiện band ở vị trí có kích thước khoảng 700 - 800 bp. Ghi nhận (-) khi không xuất hiện band ở vị trí nêu trên. 3.6. Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi khuẩn sợi tiềm năng được tuyển chọn Hai vi khuẩn sợi tuyển chọn được nuôi với trong môi trường lỏng Starch Casein lỏng trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC trong 3 ngày. Các hợp chất trong dịch nuôi cấy vi khuẩn sợi được chiết bằng theo phương pháp chiết tách lỏng – lỏng bằng dung môi ethyl acetate (Siddiquee et al., 2015). Đánh giá khả năng kháng khuẩn của mẫu cao chiết thô sau khi chiết tách. Mẫu cao chiết sau khi đánh giá khả năng kháng khuẩn để xác định hoạt tính sinh học, được đem tách chất, tinh sạch bằng phương pháp sắc ký cột, các chất sau khi được tinh sạch được phân tích bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân xác định cấu trúc hóa học, bên 7
12. cạnh đó, mẫu cao chiết này cũng được phân tích bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) để tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học. 3.7 Xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Mẫu chất sạch được gửi mẫu phân tích bằng máy phân tích cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (Viện Hóa Học, viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam) 3.8 Xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) Mẫu cao chiết được pha loãng với dung môi acetone ra các nồng độ 10 ppm; 1 ppm; 0,1 ppm và tiến hành gửi mẫu phân tích bằng máy sắc ký khí khối phổ GCMS QP2010 (Shimadzu, Nhật) tại Khoa Môi Trường và Tài Nguyên Thiên nhiên, Trường Đại học Cần Thơ, với cột phân tích SH-Rxi-5Sil MS (L30 m x ID 0,25 mm x DF 0,25 um); sử dụng khí helium làm khí mang. 8
13. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Các dòng vi khuẩn sợi phân lập được từ hải miên 4.1.1 Số lượng, nguồn gốc các dòng vi khuẩn sợi phân lập được Từ 63 mẫu hải miên ở 7 địa điểm thuộc vùng biển Hà Tiên đã phân lập được 198 dòng vi khuẩn sợi. Các vi sinh vật liên kết với hải miên vô cùng đa dạng, không chỉ có vi khuẩn, vi tảo và nấm mà còn có cả nhóm vi khuẩn sợi (Zhang et al., 2006; Montalvo et al., 2014). Bảng 4.1: Số lượng mẫu hải miên và các dòng vi khuẩn sợi phân lập được theo địa điểm thu mẫu STT Ký hiệu Nơi thu mẫu Số mẫu hải miên Số dòng vi khuẩn sợi 1 ND Núi Đèn 15 35 2 KV Hòn Kiến Vàng 3 5 3 RL Hòn Rễ Lớn 3 12 4 RN Hòn Rễ Nhỏ 6 20 5 HD Ba Hòn Đầm 15 73 6 H Hòn Heo 10 20 7 N Hòn Nghệ 11 33 Tổng số: 63 198 4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn sợi phân lập được 4.1.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn sợi phân lập được Đặc điểm về hình dạng khuẩn lạc: Khuẩn lạc có dạng tròn chiếm đa số với 117/198 dòng, chiếm tỷ lệ 59,1%, kế đến là khuẩn lạc với dạng hình tròn có sợi với 68 dòng (34,3%), tiếp theo là hình dạng khuẩn lạc có xuất hiện giọt tiết ở giữa khuẩn lạc với 8 dòng (4,1%). Chiếm tỷ lệ ít nhất là dạng khuẩn lạc có vòng đồng tâm xung quanh khuẩn lạc có sợi ăn sâu vào bề mặt môi trường với 5 dòng (2,5%). Đặc điểm về màu sắc khuẩn lạc: Khuẩn lạc nhiều nhất là màu trắng với 76/198 dòng, chiếm tỷ lệ 38,3%, kế đến là khuẩn lạc có màu vàng hay vàng nhạt với 62 dòng (31,3%), tiếp theo là khuẩn lạc màu cam với 34 dòng (17,2%). Cùng chiếm tỷ lệ ít nhất và bằng nhau là hai dạng khuẩn lạc màu đỏ và màu xám đều có 13 dòng (6,6%). Đặc điểm về dạng bìa của khuẩn lạc: Khuẩn lạc có dạng bìa nguyên với 110/198 dòng, chiếm tỷ lệ 55,6 %, trong khi đó khuẩn lạc có dạng bìa răng cưa chỉ có 88 dòng (44,4%). 9
14. Đặc điểm về độ nổi của khuẩn lạc: Khuẩn lạc có độ nổi dạng mô chiếm ưu thế với 124/198 dòng, chiếm tỷ lệ 62,6%, trong khi đó khuẩn lạc có độ nổi dạng lài chiếm, số lượng ít hơn với 74 dòng (37,4%). 4.1.2.2 Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn sợi phân lập được Đặc điểm về hình dạng tế bào: Tế bào dạng hình que ngắn nhiều nhất với 115/198 dòng, chiếm tỷ lệ 58,1%, kế đến là dạng hình que dài với 35 dòng (17,7%), tiếp theo là dạng hình que ngắn kết chuỗi với 23 dòng (11,6%) và dạng hình cầu với 20 dòng (10,1%). Dạng tế bào hình cầu kết chuỗi là ít gặp nhất chỉ xuất hiện với 5 dòng (2,5%). Đặc điểm về khả năng chuyển động của tế bào, đa số các dòng vi khuẩn sợi không chuyển động với số lượng 159/198 dòng, chiếm tỷ lệ 79,9%, còn lại 40 dòng có khả năng chuyển động (20,1%). Kết quả nhuộm Gram cho thấy 198 dòng vi khuẩn sợi đều thuộc Gram dương, chiếm tỷ lệ 100%. 4.2 Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi Trong tổng số 198 dòng vi khuẩn sợi phân lập được, có 130/198 dòng, chiếm 65,7%, có khả năng kháng ít nhất 1 dòng vi sinh vật gây bệnh. Số lượng của các dòng vi khuẩn sợi dựa theo mức độ kháng đối với các vi sinh vật thử nghiệm được trình bày ở Hình 4.1. Hình 4.1: Biểu đồ số lượng của các dòng vi khuẩn sợi dựa theo mức độ kháng đối với các vi sinh vật thử nghiệm 10
15. Khả năng kháng đối với vi khuẩn Bacillus cereus, có 82/198 dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng, chiếm tỷ lệ 41,4%, trong khi đó có 116 dòng (58,9%), không có khả năng kháng. Đánh giá mức độ kháng, ở mức độ kháng mạnh có 6 dòng (7,3%), mức độ kháng trung bình có tới 55 dòng (67,1%) và ở mức độ kháng yếu có 21 dòng (25,6%). Khả năng kháng đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus có 22/198 dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng, chiếm tỷ lệ 11,4%, trong khi đó có tới 176 dòng vi khuẩn sợi không có khả năng kháng (88,9%). Đánh giá mức độ kháng, chỉ có một dòng kháng mạnh (4,5%), 12 dòng kháng trung bình (54,6%) và 9 dòng kháng yếu (41%). Khả năng kháng đối với vi khuẩn Escherichia coli, có 39/198 dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng, chiếm tỷ lệ 19,7% và 159 dòng không có khả năng kháng (80,3%). Đánh giá mức độ kháng, ở mức độ kháng trung bình có 30 dòng (76,9%) và 9 dòng kháng yếu (23,1%). Không có dòng vi khuẩn sợi nào đạt mức kháng mạnh. Khả năng kháng đối với vi khuẩn Salmonella typhimurium, có 73/198, chiếm tỷ lệ 36,9%, trong khi đó có tới 125 dòng không có khả năng kháng (63,1%). Đánh giá mức độ kháng, có 7 dòng đạt mức độ kháng mạnh (9,6%), trong khi đó ở mức độ kháng trung bình có tới 51 dòng (69,9%) và ở mức độ kháng yếu có 15 dòng (20,5%). Khả năng kháng đối với nấm Candida albicans có 42/198 dòng, chiếm tỷ lệ 21,2%, trong khi đó có tới 156 dòng không có khả năng kháng (78,8%). Đánh giá mức độ kháng, có 8 dòng đạt mức độ kháng mạnh (19,1%), trong khi đó, số dòng kháng trung bình có tới 31 dòng (73,8%) và đạt mức độ kháng yếu chỉ có 3 dòng (7,1%). 4.3 Tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn sợi Tuyển chọn được 23 dòng vi khuẩn sợi theo tiêu chí có khả năng kháng ít nhất 2 dòng vi sinh vật chỉ thị trở lên và mức độ kháng từ trung bình đến kháng mạnh được trình bày ở Bảng 4.2. 11
16. Bảng 4.2: Khả năng kháng khuẩn của 23 dòng vi khuẩn sợi TT Dòng vi Đường kính vòng vô khuẩn [D = d1 - d2] (mm) khuẩn Bacillus Staphylococ E. coli Salmonella Candida sợi cereus -cus aureus typhimurium albicans 1. ND1.1a 15,0 f - 14,0 a - 23,0 c 2. ND1.3b 14,0 g - - 14,0 d 16,0 h 3. ND1.5a 17,0 d - - 11,0 g 12,0 k 4. ND1.7a 21,0 a - 9,0 d 12,0 f 23,7 b 5. ND1.7b 13,0 h - 14,0 a - 25,7 a 6. ND2.6c 17,0 d - 9,0 d 14,0 d 21,7 d 7. ND2.7c 21,0 a - 12,0 b 12,0 f 22,0 d 8. HD1.2c 9,0 i - 7,0 f 10,0 h 26,0 a 9. HD1.3d 15,0 f - 8,0 e 19,0 b 14,0 j 10. HD1.3e 20,0 b - 11,0 c 15,0 c 19,0 e 11. HD1.5c 17,0 d - 9,0 d 22,0 a - 12. HD1.6a 21,0 a - 8,0 e 4,0 l 18,0 f 13. HD2.1a 14,0 g - 5,0 h 19,0 b 18,0 f 14. HD2.3a 13,0 h - 14,0 a 6,0 k 16,0 h 15. HD2.3b 20,0 b - 6,0 g 15,0 c - 16. HD2.3c 18,0 c - 6,0 g 9,0 i 26,0 a 17. HD2.4a 17,0 d - 7,0 f 9,0 i 17,0 g 18. HD2.5a 15,0 f - 12,0 b 14,0 d 14,0 j 19. HD2.5d 15,0 f - - 14,0 d 12,0 k 20. HD2.7d 16,0 e - 4,0 i 13,0 e 15,0 i 21. HD2.8p 14,0 g - 11,0 c 10,0 h 14,0 j 22. HD2.9a 7,0 k - - 12,0 f 14,0 j 23. N10b 7,0 k 12,0 a - - - 24. Đối chứng 8.0 j 12.0 a 7.0 f 8.0 j 10.0 l Ampicillin Ampicillin Tetracyc- Tetracycline Fluconaz- line ole CV% 2,05 5,89 2,45 3,74 1,43 *Các chữ cái khác nhau theo sau bên phải số liệu trong cùng một cột khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 99%; “-”: không kháng. Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn sợi được so sánh độ tương đồng với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu NCBI, so sánh với các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, các đặc điểm về hình thái, đặc điểm sinh học của tế bào, xác định được tên loài của 23 dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn được trình bày ở Bảng 4.3. 12
17. Bảng 4.3: Kết quả định danh của 23 dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn TT Dòng vi Loài xác nhận Số Độ đồng khuẩn sợi Nucleotide hình (%) Họ Actinomycetaceae 1 ND1.1a Streptomyces coelicolor ND1.1a 606 100 2 ND1.3b Streptomyces griseoaurantiacus 604 100 ND1.3b 3 ND1.5a Streptomyces ramulosus ND1.5a 608 100 4 ND1.7a Streptomyces tateyamensis ND1.7a 602 100 5 ND1.7b Streptomyces ambofaciens ND1.7b 603 100 6 HD1.2c Streptomyces recifensis HD1.2c 605 100 7 HD1.3d Streptomyces olivaceus HD1.3d 605 100 8 HD1.3e Streptomyces althioticus HD1.3e 603 100 9 HD1.5c Streptomyces tateyamensis HD1.5c 604 99.83 10 HD1.6a Streptomyces flaveolus HD1.6a 604 100 11 HD2.1a Streptomyces chumphonensis 609 100 HD2.1a 12 HD2.3b Streptomyces olivaceus strain 602 100 HD2.3b 13 HD2.3c Streptomyces coelicolor HD2.3c 606 100 14 HD2.9a Streptomyces qinglanensis HD2.9a 604 100 15 N10b Streptomyces variabilis N10b 609 100 Họ Microbacteriaceae 16 ND2.7c Microbacterium tumbae ND2.7c 618 100 17 HD2.8p Microbacterium tumbae HD2.8p 610 100 Họ Nocardiaceae 18 ND2.6c Rhodococcus hoagii ND2.6c 606 100 19 HD2.3a Rhodococcus hoagii HD2.3a 604 100 20 HD2.4a Rhodococcus rhodochrous HD2.4a 603 100 21 HD2.5d Rhodococcus pyridinivorans HD2.5d 604 100 22 HD2.7d Rhodococcus hoagii HD2.7d 613 100 Họ Gordoniaceae 23 HD2.5a Gordonia bronchialis HD2.5a 604 100 Từ 23 dòng vi khuẩn sợi được xác định tên loài, thuộc nhóm Actinobacteria hay Firmicutes G+C cao, bao gồm 4 họ Actinomycetaceae với chi Streptomyces có 15 loài, chiếm tỷ lệ 65,2%, họ Microbacteriaceae với 2 loài Microbacterium tumbae, chiếm tỷ lệ 8,7%, họ Nocardiaceae với chi Rhodococcus với 5 loài, chiếm tỷ lệ 21,7% và họ Gordoniaceae với một loài là Gordonia bronchialis, chiếm tỷ lệ 4,4%. Trình tự đoạn gen của 23 dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn được phân tích mối liên hệ di truyền với phần mềm CLUSTALX, version 13
18. 1.81. và phần mềm Mega 7.0 với hệ số bootstrapping 1000 lần kết quả được trình bày ở Hình 4.2. Hình 4.2: Cây phả hệ của trình tự gen 16S rDNA của 23 dòng vi khuẩn sợi với primers (SC-Act-0235-aS-20 và SC-Act-0878-aA-19) cho thấy mối quan hệ giữa các dòng dựa trên trình tự gen từ ngân hàng gen phân tích theo phương pháp Neighbor joining của 100 lặp lại. (Khoảng cách 0.50 chỉ khoảng cách di truyền 5 thay đổi/100 bases). Từ kết quả khảo sát mối liên hệ di truyền được trình bày ở Hình 4.2 cho thấy cây phả hệ sự phân bố của 23 dòng vi khuẩn sợi chia làm hai nhánh: nhánh A gồm 14 dòng vi khuẩn sợi, có hai nhánh nhỏ là nhánh A1 với 12 dòng gồm 10 dòng thuộc nhóm Streptomyces, một dòng Microbacterium tumbae HD2.8p và dòng Rhodococcus rhodochrous HD2.4a. Nhánh A2 gồm dòng Rhodococcus hoagii HD2.7d và dòng Rhodococcus hoagii ND2.6c. Nhánh B gồm chín dòng 14
19. vi khuẩn sợi chia là hai nhánh nhỏ là nhánh B1 với bốn dòng gồm dòng Microbacterium tumbae ND2.7c ở một nhánh riêng và ba dòng Streptomyces coelicolor HD2.3c (nguồn gốc ở Hòn Đầm), Streptomyces coelicolor ND1.1a (nguồn gốc ở Núi Đèn) và Streptomyces variabilis N10b (nguồn gốc ở Hòn Nghệ) thuộc nhóm Streptomyces, điều này cho thấy, mặc dù ba dòng có vị trí địa lý khác nhau nhưng chúng có mối liên hệ di truyền gần nhau. Nhánh B2 với năm dòng gồm Rhodococcus rhodochrous HD2.4a một nhánh riêng, một nhánh là hai dòng Streptomyces recifensis HD1.2c và Streptomyces olivaceus HD1.3d và một nhánh còn lại gồm hai dòng Rhodococcus hoagii HD2.3a và Rhodococcus pyridinivorans HD2.5d, tất cả năm dòng thuộc nhánh B2 điều có cùng vị trí địa lý thu mẫu từ Ba Hòn Đầm và có mối liên hệ di truyền rất gần nhau. Có thể thấy, các dòng vi khuẩn sợi có mối quan hệ gần nhau về mặc di truyền mặc dù chúng được phân lập ở hai địa điểm khá xa nhau (Hòn Đầm và Núi Đèn), ngược lại có những dòng cùng phân lập tại một địa điểm nhưng lại được phân làm hai nhánh trong phân tích sơ đồ phả hệ. Những thay đổi dựa trên phân tích trình tự các dòng vi khuẩn sợi là do cộng đồng vi sinh vật liên kết với hải miên đa dạng theo loài hải miên và điều kiện nước biển (Hentschel et al., 2002). 4.4 Nhận diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS ở các dòng vi khuẩn sợi Hai mươi ba dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn được khảo sát sự hiện diện của các gen polyketide synthase type I (PKS-I), polyketide synthase type II (PKS-II) và gen nonribosomal peptide synthetase (NRPS) chỉ thị hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi chuyên biệt A3F/A7R cho gen NPRS, K1F/M6R cho gen PKS-I và cặp mồi KSαF/KSαR cho gen PKS-II. 15
20. Bảng 4.4: Sự hiện hiện các gen NRPS, PKS-I và PKS-II của 23 dòng vi khuẩn sợi TT Loài vi khuẩn sợi Gen NRPS Gen NPS-I Gen NPS-II Họ Actinomycetaceae 1 Streptomyces coelicolor ND1.1a - + + Streptomyces griseoaurantiacus - + - 2 ND1.3b 3 Streptomyces ramulosus ND1.5a - - + 4 Streptomyces tateyamensis ND1.7a + - + 5 Streptomyces ambofaciens ND1.7b - - + 6 Streptomyces recifensis HD1.2c - - + 7 Streptomyces olivaceus HD1.3d + + - 8 Streptomyces althioticus HD1.3e - + - 9 Streptomyces tateyamensis HD1.5c + - + 10 Streptomyces flaveolus HD1.6a + - - 11 Streptomyces chumphonensis - - + HD2.1a Streptomyces olivaceus strain - + + 12 HD2.3b 13 Streptomyces coelicolor HD2.3c - + - 14 Streptomyces qinglanensis HD2.9a - + + 15 Streptomyces variabilis N10b + + + Họ Microbacteriaceae 16 Microbacterium tumbae ND2.7c + + - 17 Microbacterium tumbae HD2.8p + + - Họ Nocardiaceae 18 Rhodococcus hoagii ND2.6c + + - 19 Rhodococcus hoagii HD2.7d + + - 20 Rhodococcus hoagii HD2.3a + + + 21 Rhodococcus rhodochrous HD2.4a - + + Rhodococcus pyridinivorans - + + 22 HD2.5d Họ Gordoniaceae 23 Gordonia bronchialis HD2.5a + + + (“+”: Có sự hiện diện của gen khảo sát; “-”: không có sự hiện diện của gen khảo sát) Từ kết quả khảo sát ở Bảng 4.4 cho thấy sự hiện diện các gen PKS-I, PKS-II và NRPS trong tất cả các loài thuộc chi Streptomyces, họ Microbacteriaceae, họ Nocardiaceae và họ Gordoniaceae. Sử dụng cặp mồi K1F/M6R phát hiện gen PKS-I ở 8 loài thuộc chi Streptomyces và tất cả các loài khảo sát còn lại thuộc họ Microbacteriaceae, họ 16
21. Nocardiaceae và họ Gordoniaceae, tổng cộng có 16/23 loài khảo sát có sự hiện diện của gen PKS-I, chiếm tỷ lệ 69,6%. Sự hiện diện của gen PKS-II gồm 14/23 loài khảo sát có sự xuất hiện của gen này khi sử dụng cặp mồi KSαF/KSαR, chiếm tỷ lệ 60,9%, gồm 10 loài thuộc chi Streptomyces, 3 loài thuộc chi Rhodococcus và 1 loài thuộc chi Gordonia là loài Gordonia bronchialis HD2.5a. Sự hiện diện của gen NRPS gồm 11/23 loài khảo sát có sự xuất hiện của gen này khi sử dụng cặp mồi A3F/A7R, chiếm tỷ lệ 47,8%, gồm 5 loài thuộc chi Streptomyces, 2 loài thuộc chi Microbacterium, 3 loài thuộc chi Rhodococcus và loài Gordonia bronchialis HD2.5a. Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự như nhiều kết quả khảo sát sự hiện diện của các gen PKS-I, PKS-II và gen NRPS trong nhóm vi khuẩn sợi đã công bố trước đây (Li et al., 2008; Ayuso-Sacido et al., 2005). 4.5 Chất kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn sợi. Hai dòng vi khuẩn Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c có khả năng kháng nhiều loại vi sinh vật và mức độ kháng mạnh được chọn để tiến hành phân tách và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học. 4.5.1 Chất kháng khuẩn từ Streptomyces tateyamensis ND1.7a. 4.5.1.1 Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Hợp chất ND1.7a được phân tích bằng máy Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) từ Viện Hóa học (Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam). Hình 4.3: Tương quan Hình 4.4: Tương quan Hình 4.5: Cấu trúc hóa HSQC trong cấu trúc HMBC trong cấu trúc học của hợp chất hợp chất ND1.7a hợp chất ND1.7a ND1.7a (Thymine) Từ các đặc điểm phổ 1D-NMR và ESI-MS như trên có thể dự đoán cấu trúc hợp chất ND1.7a có khung dị vòng thơm, 2 nguyên tử 17
22. nitơ, phù hợp với khung pyrimidine. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR của hợp chất ND1.7a thấy phù hợp với thymine (Quyen et al., 2015a) và kiểm tra lại bằng các phổ HSQC, HMBC hợp chất ND1.7a được xác định là thymine với cấu trúc hóa học trình bày như Hình 4.3, 4.4 và 4.5. Thymine được xác định là một trong 9 hợp chất sinh học được phân tách từ dòng vi khuẩn biển Micromonospora sp. G019 (Quyen et al., 2015). Ying et al. (2011) đã phân lập và xác định thymine từ nấm Penicillium sp. P-1 nội sinh trong cây Huperzia serrata. 4.5.1.2 Kết quả phân tích sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) Hình 4.6: Phổ GC-MS phân đoạn Hình 4.7: Phổ GC-MS phân đoạn hexane-acetone acetone-methanol Từ kết quả phân tích GC-MS, so sánh với thư viện phổ, loại trừ các chất có trong dung môi, tham khảo hoạt tính sinh học của các chất đã được công bố, xác định được 3 chất có hoạt tính kháng khuẩn tương ứng với các đỉnh tương ứng ở phân đoạn hexane-acetone và 3 chất có hoạt tính kháng khuẩn tương ứng với các đỉnh tương ứng ở phân đoạn acetone-methanol (Bảng 4.5 và Bảng 4.6). Bảng 4.5: Thành phần các chất có hoạt tính sinh học từ phân đoạn hexane-acetone TT Thời Tên hợp chất Khối Công thức Hoạt tính sinh học gian lượng phân phân tử lưu tử (g/mol) 1 4.64 2-pentanone, 4- 116.3 C6H12O2 Kháng vi sinh vật hydroxy-4-methyl (Shettima et al., 2013) 2 Cyclohexasiloxane C12H36O Kháng nấm (Obaseki 13.115 444 , dodecamethyl 6Si6 et al., 2016) 3 Cycloheptasiloxan C14H42O Kháng khuẩn và kháng 15.803 518 nấm (Mebude & e,tetradecamethyl 7Si7 Adeniyi, 2017) 18
23. Bảng 4.6: Thành phần các chất có hoạt tính sinh học từ phân đoạn acetone-methanol TT Thời Tên hợp chất Trọng Công Hoạt tính sinh học gian lượng thức phân lưu phân tử tử (g/mol) 1 5.09 Oxime-, 151 C8H9NO Kháng nấm, kháng khuẩn, methoxy-phenyl 2 chống ung thư (Akpuaka et al., 2013) 2 30.82 Hexanedioic 370 C22H42O Kháng oxy hóa, kháng vi acid, bis(2- 4 sinh vật (Paramanantham & Murugesan, 2014) ethylhexyl) ester 3 33.07 Diisooctyl 390 C24H38O Kháng nấm, kháng khuẩn, phthalate 4 kháng vi rút và chống oxy hóa (Akpuaka et al., 2013) Kết quả nghiên cứu đã xác định được 7 hợp chất có hoạt tính sinh học từ dòng vi khuẩn sợi Streptomyces tateyamensis ND1.7a, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn đã được báo cáo trước đây (Shettima et al., 2013; Mebude & Adeniyi, 2017; Obaseki et al., 2016; Akpuaka et al., 2013; Rahdary & Sobati, 2012; Hong et al., 2010; Paramanantham & Murugesan, 2014; Kadhim et al., 2017). 4.5.2 Chất kháng khuẩn từ Microbacterium tumbae ND2.7c. Cao chiết thô của dòng vi khuẩn sợi Microbacterium tumbae ND2.7c được pha loãng trong acetone và phân tích GC-MS với nồng độ 0,1 ppm. Hình 4.8: Kết quả GC-MS của dòng vi khuẩn sợi Microbacterium tumbae D2.7c (nồng độ 0,1ppm) 19
24. Từ các kết quả phân tích GC-MS, so sánh với thư viện phổ, loại trừ các chất có trong dung môi, tham khảo hoạt tính sinh học của các chất đã được công bố, xác định được các chất có hoạt tính kháng khuẩn tương ứng với các đỉnh tương ứng (Bảng 4.7) Bảng 4.7: Thành phần các chất có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn sợi Microbacterium tumbae ND2.7c (nồng độ 0,1 ppm) TT Thời Tên hợp chất Trọng Công thức Hoạt tính sinh học gian lượng phân tử lưu phân tử (g/mol) 1. 5.752 Cyclopentasiloxane 370 C10H30O5 - Kháng khuẩn: Keskın et al., 2012); (Mahmud et , decamethyl- Si5 al., 2018); (Jasim et al., 2015); (Alsaedi et al., 2020); (Thambidurai et al., 2017) 2. 8.080 Tetrasiloxane, 3.5- 518 C16H46O7 Kháng khuẩn (Alsaedi et al., 2020) diethoxy- Si6 1.1.1.7.7.7- hexamethyl-3.5- bis(trimethylsiloxy) 3. 9.344 1-dodecene 168 C12H24 Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa (Abdelwahab et al., 2010); (Saravanakumar et al., 2016) 4. 10.267 3-isopropoxy- 567 C18H52O7 Kháng khuẩn (Alsaedi et al., 2020); 1.1.1.7.7.7- Si7 hexamethyl-3.5.5- (Thambidurai et al., tris(trimethylsiloxy) 2017) tetrasiloxane 5. 10.813 3, 5 di-t- 206 C14H22O Kháng khuẩn butylphenol (Alsaedi et al., 2020); (Thambidurai et al., 2017) 6. 11.804 Phthalic acid 222 C12H14O4 Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa (Jasim et al., 2015); (Alsaedi et al., 2020); (Manigundan et al., 2020) 7. 12.234 3.4- 472 C20H40O5 Kháng khuẩn, kháng oxy dihydroxymandelic hóa (Shunmugapriya et Si4 acid 4TMS al., 2017) 8. 12.439 1,6 200 C10H16O4 Kháng khuẩn, kháng oxy dioxacyclododecan hóa (Meshram et al., e-7,12-dione 2015) 20
25. TT Thời Tên hợp chất Trọng Công thức Hoạt tính sinh học gian lượng phân tử lưu phân tử (g/mol) 9. 12.984 2-propyl-1-pentanol 130 C8H18O Kháng nấm (Ye et al., 2020) 10. 14.038 2-(2’.4’.4’.6’.6’.8’.8’- 652 C16H48O10 kháng khuẩn heptamethyltetrasiloxa (Thambidurai et al., Si9 n-2’yloxy)- 2017); (Gadhi et al., 2.4.4.6.6.8.8.10.10- 2018) nonamethylcyclopenta siloxane 11. 15.886 Phthalic acid, 194 C10H10O4 Kháng khuẩn, kháng monoethyl ester nấm, kháng oxy hóa (Jasim et al., 2015); (Alsaedi et al., 2020); (Manigundan et al., 2020) Kết quả nghiên cứu đã xác định được 11 hợp chất có hoạt tính sinh học từ dòng vi khuẩn sợi Microbacterium tumbae dòng ND2.7c, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn đã được báo cáo trước đây (Bảng4.7). Với các chất có hoạt tính sinh học đã được xác định và kết quả thử nghiệm khả năng ức chế đối với các loại vi sinh vật thử nghiệm, dòng vi khuẩn sợi Microbacterium tumbae ND2.7c có khả năng kháng Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium và nấm men Candida albicans có tiềm năng trong nghiên cứu ứng dụng sản xuất ra các chất có hoạt tính sinh học cao. Vi khuẩn sợi Microbacterium sp. được biết đến như nguồn sản xuất kháng sinh từ các hoạt tính kháng khuẩn của chúng (Kanagasabhapathy et al., 2008) và các sản phẩm có hoạt tính sinh học tự nhiên quan trọng đối với dược phẩm như glucosylmannosyl-glycerolipid (Lang et al., 2004). Ngoài loài Microbacterium tumbae, một loài khác trong chi Microbacterium cũng có khả năng kháng Bacillus cereus, Escherichia coli và Staphylococcus aureus như loài Microbacterium resistens (Wang et al., 2016). Kết quả của Abdelmohsen et al., (2010) cũng nhận thấy Microbacterium sp. và Rhodococcus sp. phân lập từ hải miên có tính kháng khuẩn như Staphylococcus aureus và Enterococcus faecalis nhưng cả hai lại không kháng nấm Candida albicans. 21
26. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Đề tài đã thực hiện được bộ sưu tập gồm 198 dòng vi khuẩn sợi phân lập từ hải miên ở vùng biển Hà Tiên, trong đó 130/198 dòng (đạt 65,7%) có khả năng kháng lại ít nhất một trong năm loài vi sinh vật được thử nghiệm gồm Bacillus cereus (82 dòng, đạt 41,4%), Salmonella typhimurium (73 dòng, đạt 36,9%), Candida albicans (42 dòng, đạt 21,2%), Escherichia coli (39 dòng, đạt 19,7%) và Staphylococcus aureus (22 dòng, đạt 11,4%). Mức độ kháng của các dòng vi khuẩn sợi đối với các vi sinh vật thử nghiệm có sự khác nhau: Đối với Bacillus cereus, có 6 dòng kháng mạnh (đạt 7,3%), 55 dòng kháng trung bình (67,1%) và 21 dòng kháng yếu (25,6%). Đối với Staphylococcus aureus chỉ có một dòng kháng mạnh (4,5%), 12 dòng kháng trung bình (54,6%) và 9 dòng kháng yếu (41%). Đối với Escherichia coli có 30 dòng kháng trung bình (76,9%) và 9 dòng kháng yếu (23,1%), không có dòng vi khuẩn sợi nào đạt mức kháng mạnh. Đối với Salmonella typhimurium có 7 dòng kháng mạnh (9,6%), 51 dòng kháng trung bình (69,9%) và 15 dòng kháng yếu (20,5%). Đối với Candida albicans có có 8 dòng kháng mạnh (19,1%), 31 dòng kháng trung bình (73,8%) và 3 dòng kháng yếu (7,1%). Tuyển chọn được hai mươi ba dòng vi khuẩn sợi đã được tuyển chọn và định danh do có khả năng kháng ít nhất hai dòng vi sinh vật chỉ thị trở lên với mức độ kháng từ trung bình đến kháng mạnh. Các dòng vi khuẩn sợi tuyển chọn thuộc 4 họ bao gồm họ Actinomycetaceae (chiếm tỷ lệ 65,2%), Microbacteriaceae (8,7%), Nocardiaceae (21,7%) và Gordoniaceae (4,4%). Tỷ lệ hiện diện các gen chỉ thị sản xuất các chất có hoạt tính sinh học được ghi nhận có sự khác nhau. Gen PKS-I xuất hiện ở 16/23 loài khảo sát, chiếm tỷ lệ 69,6%, gồm ở 8 loài thuộc chi Streptomyces và tất cả các loài khảo sát còn lại thuộc họ Microbacteriaceae, họ Nocardiaceae và họ Gordoniaceae. Gen PKS-II xuất hiện ở 14/23 loài 22
27. khảo sát, chiếm tỷ lệ 60,9%, gồm 10 loài thuộc chi Streptomyces, 3 loài thuộc chi Rhodococcus và 1 loài thuộc chi Gordonia. Gen NRPS xuất hiện ở 11/23 loài khảo sát, chiếm tỷ lệ 47,8%, gồm 5 loài thuộc chi Streptomyces, 2 loài thuộc chi Microbacterium, 3 loài thuộc chi Rhodococcus và loài Gordonia bronchialis. Hai dòng vi khuẩn sợi tiềm năng nhất có khả năng kháng khuẩn cao đã được định danh là Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae ND2.7c. Bảy hợp chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ Streptomyces tateyamensis ND1.7a đã được xác định, gồm có: thymine; 2-Pentanone-4-hydroxy-4-methyl; cyclohexasiloxane dodecamethyl; cycloheptasiloxane tetradecamethyl; oxime- methoxy- phenyl; hexanedioic acid bis (2-ethylhexyl) ester và diisooctyl phthalate. Đối với Microbacterium tumbae ND2.7c, 11 hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định bao gồm: cyclopentasiloxane decamethyl-; tetrasiloxane 3.5-diethoxy-1.1.1.7.7.7-hexamethyl-3.5-bis (trimethylsiloxy); 1-dodecene; 3-isopropoxy-1.1.1.7.7.7-hexamethyl- 3.5.5-tris(trimethylsiloxy) tetrasiloxane; 3,5-di-t-butylphenol; phthalic acid; 3.4-dihydroxymandelic acid 4TMS; 1.6-dioxacyclododecane-7-12- dione; 2-Propyl-1-pentanol; 2-(2’.4’.4’.6’.6’.8’.8’- heptamethyltetrasiloxan-2’yloxy)-2.4.4.6.6.8.8.10.10- nonamethylcyclopentasiloxane và phthalic acid monoethyl ester. Kết quả của đề tài về các hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích, đặc biệt là khả năng kháng nấm và kháng khuẩn, là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra loại dược phẩm mới sản xuất từ các vi sinh vật cộng sinh với hải miên góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người. 5.2 Đề xuất Nghiên cứu các đặc điểm, hoạt tính sinh học của các hợp chất được phát hiện từ hai dòng vi khuẩn sợi Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae dòng ND2.7c như khả năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng tế bào ung thư, kháng oxy hóa, cũng như mức độ an toàn khi sử dụng. 23
28. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học của hai dòng vi khuẩn sợi Streptomyces tateyamensis ND1.7a và Microbacterium tumbae dòng ND2.7c nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy tối ưu ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất các hoạt chất sinh học từ hai dòng vi khuẩn sợi này. 24
29. TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdelmohsen, U. R., Pimentel-Elardo, S. M., Hanora, A., Radwan, M., Abou- El-Ela, S. H., Ahmed, S., & Hentschel, U. (2010). Isolation, phylogenetic analysis and anti-infective activity screening of marine sponge-associated actinomycetes. Marine drugs, 8(3), 399-412. Abdelwahab, S. I., Zaman, F. Q., Mariod, A. A., Yaacob, M., Abdelmageed, A. H. A., & Khamis, S. (2010). Chemical composition, antioxidant and antibacterial properties of the essential oils of Etlingera elatior and Cinnamomum pubescens Kochummen. Journal of the Science of Food and Agriculture, 90(15), 2682-2688. Akpuaka, A., Ekwenchi, M. M., Dashak, D. A., & Dildar, A. (2013). Biological activities of characterized isolates of n-hexane extract of Azadirachta indica A. Juss (Neem) leaves. New York Science Journal, 6(6), 119-124. Alanis, A.J., (2005). Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research, 36(6), 697-705. Alsaedi, F. B., Ullah, I., Al-Shaer, M., Al-Hindi, R. R., & Al-Ghamd, K. M. S., (2020). GC-MS Profiling of Anti-bacterial Metabolic Compounds from the Extract of Azadirachta indica. Abasyn Journal of Life Sciences, 3(1), 17-23. Asha Devi, N.K., Jeyarani, M., & Balakrishnan, K. (2006). Isolation and identification of marine actinomycestes and their potential in antimicrobial activity. Pakistan Journal of Biological Sciences, 9(3), 470-472. Aslan, B., (1999). Studies on isolation, characterization and antibiotic producttion of Strptomyces species. PhD thesis, Cukurova University, Institute of Science, Adana. Ayuso-Sacido, A., Clark, D., González, I., Salazar, O., Anderson, A., & Genilloud, O. (2005). A novel actinomycete strain de-replication approach based on the diversity of polyketide synthase and nonribosomal peptide synthetase biosynthetic pathways. Applied Microbiology and Biotechnology, 67(6), 795-806. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., & Turck, M. (1966). Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. American journal of clinical pathology, 45(4), 493. Calcinai, B., Azzini, F., Bavestrello, G., Cerrano, C., Pansini, M., & Thung, D. C. (2006). Boring sponges from Ha Long Bay, Tonkin Gulf, Vietnam. Zoological studies, 45(2), 201-212. Cho, H. H., Shim, E. J., & Park, J. S. (2010). Phylogenetic Diversity of Bacteria Associated with the Marine Sponges, Spirastrella abata and Cinachyrella 25
30. sp. The Korean Journal Microbiol, 46(2), 177-182. Cường, P. V., Anh, N. M., Quyên, V. T., & Cúc, N. T. K. (2014). Phân lập, tuyển chọn và định danh một số chủng vi khuẩn liên kết sáu loài hải miên vùng biển Sơn Chà. Tuyển tập Hội nghị Khoa học toàn quốc về Sinh học biển và Phát triển bền vững lần thứ II, 569-574. NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. Gadhi, A. A. A., El-Sherbiny, M. M. O., Al-Sofyani, A. M. A., Ba-Akdah, M. A., and Satheesh, S. (2018). Antibiofilm activities of extracts of the macroalga Halimeda sp. from the Red Sea. Journal of Marine Science and Technology, 26(6), 838-846. Hentschel, U., Hopke, J., Horn, M., Friedrich, A. B., Wagner, M., Hacker, J., & Moore, B. S. (2002). Molecular evidence for a uniform microbial community in sponges from different oceans. Applied and environmental microbiology, 68(9), 4431-4440. Hong, Y., Huang, S., Wu, J., & Lin, S. (2010). Identification of essential oils from the leaves of 11 species of Eriobotrya. Pakistan Journal of Botany, 42(6), 4379-4386. Jasim, H., Hussein, A. O., Hameed, I. H., & Kareem, M. (2015). Characterization of alkaloid constitution and evaluation of antimicrobial activity of Solanum nigrum by using GC-MS. Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, 7(4), 56-72. Kadhim, M. J., Al-Rubaye, A. B., & Hameed, I. H. (2017). Determination of Bioactive Compounds of Methanolic Extract of Vitis vinifera Using GC- MS. International Journal of Toxicological and Pharmacological Research. 9(2), 113-126. Kanagasabhapathy, M., Sasaki, H., & Nagata, S. (2008). Phylogenetic identification of epibiotic bacteria possessing antimicrobial activities isolated from red algal species of Japan. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24(10), 2315-2321. Kennedy, J., Baker, P., Piper, C., Cotter, P.D., Walsh, M., Mooij, M.J., Bourke, M.B., Rea, M.C., O’Connor, P.M., Ross, R.P., Hill, C., O’Gara, F., Marchesi, J.R., & Dobson, A.D.W. (2009). Isolation and Analysis of Bacteria with Antimicrobial Activities from the Marine Sponge Haliclona simulans Collected from Irish Waters. Marine Biotechnology, 11, 384–396. Keskın, D., Ceyhan, N., Ugur, A., & Dbeys, A. D. (2012). Antimicrobial activity and chemical constitutions of West Anatolian olive (Olea europaea L.) leaves. Journal of Food, Agriculture & Environment, 10(2), 99-102. Koopmans, M., Martens, D., & Wijffels, R. H. (2009). Growth efficiency and carbon balance for Haliclona oculata. Marine Biotechnology, 12(3), 340- 26
31. 349. Lang, S., Beil, W., Tokuda, H., Wicke, C., & Lurtz, V. (2004). Improved production of bioactive glucosylmannosyl-glycerolipid by sponge- associated Microbacterium species. Marine Biotechnology, 6(2), 152-156. Li, C.W., Chen, J. Y., & Hua, T.E. (1998). Precambrian sponges with cellular structures. Science, 279, 879-882. Li, J., Lu, C. H., Zhao, B. B., Zheng, Z. H., & Shen, Y. M. (2008). Phaeochromycins F–H, three new polyketide metabolites from Streptomyces sp. DSS-18. Beilstein Journal of Organic Chemistry, 4(46), 1–5. Mahmud, P. I. A. M., Yaacob, W. A., Ibrahim, N., & Bakar, M. A. (2018). Antibacterial Activity and Major Constituents of Polyalthia cinnamomea Basic Fraction. Sains Malaysiana, 47(9), 2063–2071. Manigundan, K., Joseph, J., Ayswarya, S., Vignesh, A., Vijayalakshmi, G., Soytong, K., Gopikrishnan, V., & Radhakrishnan, M. (2020). Identification of biostimulant and microbicide compounds from Streptomyces sp. UC1A-3 for plant growth promotion and disease control. International Journal of Agricultural Technology, 16(5), 1125-1144. Mebude, O. O., & Adeniyi, B. (2017). GC-MS Analysis of Phyto Components from the Stem Bark of Cola nitida Schott & Endl. Journal of Plant Sciences, 5(4), 99-103. Meshram, V., Gupta, M., & Saxena, S. (2015). Muscodor ghoomensis and Muscodor indica: New endophytic species based on morphological features and molecular and volatile organic analysis from Northeast India. Sydowia, 67(15), 133–146. Montalvo, N. F., Davis, J., Vicente, J., Pittiglio, R., Ravel, J., & Hill, R. T. (2014). Integration of culture-based and molecular analysis of a complex sponge-associated bacterial community. PLoS One, 9(3), e90517. Obaseki, O. E., Adesegun, O. I., Anyasor, G. N., & Abebawo, O. O. (2016). Evaluation of the anti-inflammatory properties of the hexane extract of Hydrocotyle bonariensis Comm. Ex Lam. leaves. African Journal of Biotechnology, 15(49), 2759-2771. Paramanantham, M., & Murugesan, A. (2014). GC-MS analysis of Holarrhena antidysentrica Wall Flower. International Journal of Science, Engineering and Technology Research (IJSETR), 3(3), 631-639. Piel, J., Hui, D., Fusetani, N. & Matsunaga S. (2004). Targeting modular polyketide synthases with iteratively acting acyltransferases from metagenomes of uncultured bacterial consoria. Environmental 27
32. Microbiology, 6(9), 921-927. Quyen, V. T., Hieu, T. V., Vinh, L. C., Huong, D. T. M., Minh, L. T. H., Murphy, B., Minh, C. V., & Cuong, P. V. (2015a). Secondary metabolites produced by marine bacterium micromonospora sp. G019. Vietnam Journal of Chemistry, 53(2e), 150-153. Rahdary, A.A. & Sobati, Z. (2012). Chemical composition of essential oil, antibacterial activity and brine shrimp lethality of ethanol extracts from Sedum pallidum. Journal of Medicinal Plants Research, 6(16), 3105-3109. Saravanakumar, K., Ramkumar, B., & Muthuraj, V. (2016). In vitro antimicrobial potential efficiency of Clathria frondifera marine sponge. International Journal of Research in Pharmacy and Chemistry, 6(3), 458- 464. Schirmer, A., Gadkari, R., & Reeves, C. D. (2005). Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta. Applied and Environmental Microbiology, 71(8); 4840-4849. Shettima, A.Y., Karumi, Y., Sodipo, O.A., Usman, H. & Tijjani, M.A. (2013). Gas Chromatography–Mass Spectrometry (GC-MS) Analysis of Bioactive Components of Ethyl acetate Root Extract of Guiera senegalensis J.F. Gmel. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 3(03), 146-150. Shunmugapriya, K., Vennila, P., Thirukkumar, S., & Ilamaran, M. (2017). Identification of bioactive components in Moringa oleifera fruit by GC-MS. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 6(3), 748-751. Siddiquee, S., Azad, S. A., Bakar, F. A., Naher, L., & Kumar, S. V. (2015).Separation and identification of hydrocarbons and other volatile compounds from cultures of Aspergillus niger by GC–MS using two different capillary columns and solvents. Journal of Saudi Chemical Society, 19(3), 243-256. Sirisha, B., Haritha, R., Jaganmohan, Y. S. Y. V., Sivakumar, K., & Ramana, T. (2013). Bioactive compounds from Marine actinomycetes isolated from the sediments of Bay of Bengal. International Journal of Pharmaceutical, Chemical and Biological Sciences, 3(2), 256-264. Stach, J. E. M., Maldonado, L. A., Ward, A. C., Goodfellow, M. & Bull, A. T. (2003). New primers for the class Actinobacteria: application to marine and terrestrial environments. Environmental Microbiology, 5(10), 828-841, 2003. Taylor, M. W., Radax, R., Steger, D., & Wagner, M. (2007). Sponge-associated microorganisms: Evolution, ecology, and biotechnological potential. 28
33. Microbiology And Molecular Biology Reviews, 71(2), 295–347. Vacelet, J., & Donadey, C. (1977). Electron microscope study of the association between some sponges and bacteria. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 30(3), 301-314. Wang, C., Singh, P., Kim, Y. J., Mathiyalagan, R., Myagmarjav, D., Wang, D., & Yang, D. C. (2016). Characterization and antimicrobial application of biosynthesized gold and silver nanoparticles by using Microbacterium resistens. Artificial cells, nanomedicine, and biotechnology, 44(7), 1714- 1721. Watson D.I, & Barnes, D.K. (2004). Temporal and spatial components of variability in benthic recruitment, a 5-year temperate example. Marine Biology, 145, 201-214. Wilkinson, C. R., (1978). Microbial associations in sponges. III. Ultrastructure of the in situ associations in coral reef sponges. Marine Biology, 49(2), 177- 185. Ye, Y., Zeng, Q., Liu, K., & Qingmei, Z. (2020). Screening of Antifungal Substances from Bovistella Radicata (Mont.) Pat and Their Antifungal Effect. 10.21203/rs.3.rs-33942/v1. Ying, Y. M., Zhan, Z. J., Ding, Z. S., & Shan, W. G, 2011. Bioactive metabolites from Penicillium sp. P-1, a fungal endophyte in Huperzia serrata. Chemistry of Natural compounds, 47(4), 541. Zhang, H. T., Lee, Y. K., Zhang, W., & Lee, H. K. (2006). Culturable actinobacteria from the marine sponge Hymeniacidon perleve: Isolation and phylogenetic diversity by 16S rRNA Gene-RFLP analysis. Antonie Van Leeuwenhoek, 90(2), 159-169. 29