Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp..

Nội dung tài liệu: Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 62420201 LÊ UYỂN THANH PHÂN LẬP VI KHUẨN Xanthomonas spp. GÂY BỆNH ĐỐM LÁ TRÊN CÂY HOA HỒNG (Rosa spp.) VÀ CÂY ỚT (Capsicum spp.) TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG PHÒNG TRỊ BỆNH NĂM 2021
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: TS. Nguyễn Đức Độ Người hướng dẫn phụ: TS. Trần Đình Giỏi Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp cơ sở. Họp tại: Phòng bảo vệ luận án tiến sĩ, lầu 2, nhà điều hành, trường Đại học Cần Thơ. Vào lúc 14 giờ ngày 4 tháng 5 năm 2022. Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Đức Hoàng Phản biện 2: PGS. TS. Hà Viết Cường Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội đồng PGS.TS. Nguyễn Văn Thành Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. - Thư viện Quốc gia Việt Nam
3. DANH MỤC NHỮNG BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ [1] Lê Uyển Thanh, Tô Lan Phương, Trần Đình Giỏi, Nguyễn Đức Độ (2021). Phân lập và xác định vi khuẩn từ vùng sinh thái bản địa có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.). Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ISSN 1859-4581 (Số chuyên đề Công nghệ Sinh học trong Nông nghiệp, 18: 29-35. [2] Lê Uyển Thanh, Tô Lan Phương, Trần Đình Giỏi, Nguyễn Đức Độ (2021). Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn bản địa đối kháng triển vọng đối với bệnh đốm lá (Xanthomonas spp.) trên cây hoa hồng (Rosa spp.). Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam ISSN 1859- 1558, 10 (131): 94-99.
4. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, sản xuất nông nghiệp phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật vì chúng cho hiệu lực cao và hiệu quả nhanh chóng. Tuy nhiên, thực trạng biến đổi khí hậu ngày càng khiến canh tác nông nghiệp gặp nhiều khó khăn với vệc cây trồng sinh trưởng phát triển không hiệu quả, dịch bệnh dễ bùng phát, và tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng trở nên trầm trọng. Tại Đồng Tháp, gần đây đã xuất hiện nhiều dịch bệnh nghiêm trọng. Trong đó, bệnh đốm lá vi khuẩn do chi Xanthomonas gây ra trên hai loài cây trồng chủ lực của tỉnh là cây ớt và cây hoa hồng lửa là đặc biệt nghiêm trọng. Do nông dân đã canh tác liên tục trong năm để tăng thu nhập, kết hợp với việc mở rộng không ngừng vùng chuyên canh đã tạo điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh phát triển và gây hại. Để đối phó với bệnh đốm lá vi khuẩn, cây bệnh mới phát thường bị nhổ bỏ ngay hoặc hạn chế tưới nước, phun các loại thuốc hóa học đặc trị vi khuẩn. Tuy nhiên, các biện pháp này chỉ là giải pháp tạm thời vì việc sử dụng thuốc hóa học phổ rộng và lâu dài sẽ rất tốn kém, gây hại cho thiên địch và các vi sinh vật có lợi, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng và dễ làm mầm bệnh kháng thuốc. Do đó, cần tập trung nghiên cứu phát triển các phương pháp mới giúp kiểm soát bệnh cây trồng một cách thành công và không tác động xấu đến sức khoẻ con người và môi trường. Trong trường hợp này, kiểm soát sinh học là một giải pháp thay thế tiềm năng và mang nhiều ưu điểm về tính bền vững, phương thức hoạt động và độc tính so với thuốc trừ bệnh hóa học (Bale et al., 2008). Chúng phân tán nhanh hơn vào môi trường và thường ít độc hơn đối với các loài không phải mục tiêu. Ngoài ra, vì sử dụng các phương thức tác động khác với thuốc trừ bệnh hóa học thông thường nên chúng có thể giúp ngăn chặn các mầm bệnh kháng thuốc (Marasco et al., 2012; Bhattacharyya et al., 2016). Xuất phát từ những hiện trạng trên, luận án “Phân lập vi khuẩn 1
5. Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng (Rosa spp.) và cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh đồng tháp và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng phòng trị bệnh” đã được nghiên cứu và thực hiện. 1.2 Mục tiêu của luận án Phân lập và xác định được các dòng vi khuẩn Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng lửa (Rosa spp.) và cây ớt cay (Capsicum spp.). Tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn do Xanthomonas spp. gây ra. 1.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây hại và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng lửa và cây ớt cay. Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp. được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa. Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng. Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh tiềm năng trong điều kiện ngoài đồng. 1.4 Tính mới của luận án Nghiên cứu đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây ớt nhờ vào các kỹ thuật sinh hóa, MALDI-TOF-MS và sinh học phân tử như MLSA. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhận các dòng B. velezensis (BR16), B. subtilis (BR37, BP49, X61), Bacillus spp. (BP11, X32), Enterobacter spp. (T11), Serratia spp. (X16) có khả năng đối kháng đáng kể. Đặc biệt, nghiên cứu đã tuyển chọn được B. amyloliquefaciens BR88, B. velezensis BP103, B. subtilis G24 có khả năng kiểm soát bệnh đốm lá 2
6. vi khuẩn hiệu quả nhất dựa trên các thí nghiệm sàng lọc in vitro, nhà lưới, ngoài đồng, và xác định danh pháp bằng kỹ thật phân tích MALDI-TOF- MS và Sinh học phân tử. Các dòng vi khuẩn này có thể được sử dụng như tác nhân sinh học phòng trị bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt. 1.5 Phạm vi và đối tượng nghiên cứu 1.5.1 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm khi phân lập vi khuẩn gây bệnh và tuyển chọn in vitro các dòng vi khuẩn đối kháng. Nghiên cứu đánh giá khả năng gây hại của các dòng Xanthomonas spp. và đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn đối kháng được thực hiện ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. 1.5.2 Đối tượng nghiên cứu Giống cây hoa hồng lửa và cây ớt chỉ thiên được sử dụng trong thí nghiệm, đây là giống được người dân trồng phổ biến tại tỉnh Đồng Tháp và được người dân đánh giá là giống có tỷ lệ nhiễm bệnh nhiều nhất. Bên cạnh đó, vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn đối kháng được phân lập từ tỉnh Đồng Tháp. 1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.6.1 Ý nghĩa khoa học Dựa trên các kỹ thuật phân tích liên quan đến sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại, các kết quả đã được xử lý bằng các phân tích khoa học trên phần mềm được công nhận đã cung cấp một nguồn thông tin khoa học, tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả xác định được các dòng gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng cũng như trên cây ớt. Đồng thời qua các kỹ thuật này cũng xác định được các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng, góp phần vào chứng minh và khẳng định khả năng áp dụng vào thực tế sản xuất của các dòng vi khuẩn đối kháng này. 1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn 3
7. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học hướng đến sử dụng các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng trong kiểm soát bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt trong điều kiện sản xuất thực tế, phục vụ sự phát triển nông nghiệp theo hướng bền vững. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về chi Xanthomonas gây bệnh trên thực vật Xanthomonas là một chi vi khuẩn lớn gây bệnh trên thực vật, có phản ứng gram âm, hình que và sắc tố vàng. Chúng gây bệnh trên 400 loài vật phân bố trên toàn thế giới và là tác nhân gây bệnh nhiều cây trồng quan trọng như: lúa, cam quýt, sắn, cà chua, mía đường, chanh dây, chuối. Một số Xanthomonas spp. gây bệnh cho các loài cây thuộc họ Rosaceae đã được báo cáo, như Xanthomonas fragariae trên dâu tây (Robert et al., 1997), X. pruni trên đào (Wert et al., 2006). Tuy nhiên, rất ít báo cáo về Xanthomonas spp. gây bệnh về hoa hồng (Rosa spp.), một thành viên của họ Rosaceae, bước đầu ghi nhận dòng vi khuẩn này trên cây hoa hồng thuộc loài Xanthomonas euvesicatoria (Huang et al. 2013; Barak et al., 2016). Trên họ Solanaceae, Jones et al. (2004) đã ghi nhận rằng tất cả vi khuẩn thuộc Xanthomonas gây bệnh đốm lá vi khuẩn được phân thành 4 loài là X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans, và X. gardneri. Trong đó, X. euvesicatoria và X. vesicatoria gây bệnh trên cả ớt và cà chua. Trong khi, một số loài Xanthomonas spp. chỉ gây bệnh trên cà chua như X. perforans and X. gardneri. Tuy nhiên, gần đây Potnis et al. (2015) lại ghi nhận X. perforans đã xuất hiện trên ớt. Tại Hàn Quốc, Myung et al. (2015) và Kyeon et al. (2016) đã ghi nhận Xanthomonas euvesicatoria gây bệnh trên ớt (Capsicum sp.). 2.2 Các nghiên cứu về Xanthomonas sp. gây bệnh đốm lá trên hoa hồng và cây ớt 4
8. 2.2.1 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng Năm 2013, Huang et al. tiến hành nghiên cứu bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng (Rosa spp.) tại Hoa Kỳ. Kết quả ghi nhận những dòng vi khuẩn này ít có sự biến đổi di truyền đáng kể, chỉ có hai haplotype, và rơi vào X. axonopodis phân nhóm 9.2 (Rademaker et al., 2005), cách đặt tên mầm bệnh rosa được đề xuất theo quyết định danh pháp được mô tả trước đây. Barak et al. (2016) đã giải trình tự toàn bộ gen đã kết luận dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng là Xanthomonas euvesicatoria pv. rosa. Tên X. euvesicatoria pv. rose cũng được công nhận và sử dụng để nghiên cứu về vi khuẩn Xanthomonas gây bệnh hoa hồng (Fan et al., 2022). 2.2.2 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt Myung et al (2009) đã tiến hành ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh đốm lá trên cây ớt ngọt (Capsicum annuum L.) trong nhà kính thương mại ở Jinju, Hàn Quốc vào năm 2014, kết quả cho thấy có tỷ lệ mắc bệnh đốm lá là 35%, với các triệu chứng đốm lá điển hình trên cây con. Chuỗi gen của các dòng được phân lập có sự tương đồng 100% với gen của X. euvesicatoria ICMP 109T. Một nghiên cứu khác của Kyeon et al. (2016) với 72 mẫu bệnh trên cây ớt trên khắp Hàn Quốc được sử dụng để xác định tác nhân gây bệnh. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy đốm vi khuẩn trên cây ớt ở Hàn Quốc chỉ do X. euvesicatoria gây ra. Gần đây, Myung et al. (2015) đã ghi nhận rằng dòng mới nhất gây bệnh đốm vi khuẩn trên ớt ở Hàn Quốc là do X. euvesicatoria. 2.3 Các nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trong việc kiểm soát mầm bệnh do Xanthomonas spp. gây ra trên cây trồng Các dòng vi sinh vật thuộc nhóm xạ khuẩn Streptomyces sp., Bacillus spp. có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây bệnh bạc lá lúa, với 4 dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus spp. PD17, PD13.1 (Oanh, 2020). Ngoài ra, Bacillus velezensis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens trong việc kiểm soát mầm bệnh thực vật 5
9. do vi khuẩn (Mirik et al., 2008, Huang et al., 2012; Liu et al., 2016; Fira et al., 2018; Liu et al., 2018). Kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng vi sinh vật và các sản phẩm của chúng đã được chứng minh là đạt hiệu quả trong việc kiểm soát các loài thuộc chi Xanthomonas (Lanna Filho et al., 2010; Murate et al., 2015; Daungfu et al., 2018; Príncipe et al., 2018). Vì vậy, những nghiên cứu gần đây trong việc tìm kiếm các vi sinh vật để kiểm soát sinh học của một số loài Xanthomonas quan trọng đối với nền kinh tế thế giới ngày càng được quan tâm. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Thời gian: Từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 12 năm 2019. - Địa điểm thực hiện: Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần thơ; Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long; Trường Đại học Đồng Tháp. 3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.2.1 Dụng cụ và thiết bị Lame, Lamelle, đĩa petri, ống nghiệm, ống falcon, bình tam giác, đũa khuấy, eppendorf, micropipette, Tủ cấy, máy đo pH, Vortex, máy ly tâm, máy lắc ngang, water bath, tủ ủ ấm, tủ lạnh trữ mẫu, kính hiển vi, tủ thanh trùng khô, autoclave, cân điện tử. 3.2.2 Vật liệu Các hóa chất cần thiết cho các môi trường, isoamyl alcohol (Merk), sodium acetate (Merk), ethanol 95%, ethanol 70%, nước cất 2 lần, Tris HCl (pH 8,0), TE buffer 1X (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA), Mastermix (Phusa), ethium bromide (Merk), loading buffer 10 X, ladder 1 kb (Thermo scientific), ladder 100 bp (Thermo scientific), agarose (Merk), 1X TAE buffer (400mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 8), cặp mồi chung 27F/1492R (Weisburg, 1991), 6 cặp mồi cho các gen 6
10. housekeeping fusA, gap1, gltA, gyrB, lacF, và lepA (Ameida et al., 2010), giống cây hoa hồng lửa, cây ớt chỉ thiên, vi khuẩn gây bệnh đốm lá (từ cây bệnh tại Đồng Tháp) và vi khuẩn được phân lập từ cơ chất, đất vùng rễ, đất vùng sinh thái bản địa. Đối với các thí nghiệm nhà lưới và ngoài đồng sử dụng Cây hoa hồng thuộc giống hồng lửa được trồng trong chậu nhựa, trên giá thể là rơm oai mục, sau 45 ngày trồng và được cắt cành vào 7 ngày trước khi thí nghiệm. Cây ớt được trồng từ hạt (2 tuần),sau đó được trồng trong chậu nhựa chứa giá thể vô trùng gồm đất, xơ dừa và trấu, phân mùn với tỷ lệ 5:3:2, xử lý các thí nghiệm trên lá của cây con đạt 4 tuần tuổi. 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Luận án đã thực hiện 14 thí nghiệm, tương ứng với 4 nhóm nội dung là (1) Phân lập, khảo sát khả năng gây hại và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng lửa và cây ớt cay, với 3 thí nghiệm; (2) Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp. được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa, 4 thí nghiệm; (3) Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng, 4 thí nghiệm; (4) Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh tiềm năng trong điều kiện ngoài đồng, 4 thí nghiệm. 3.3.1 Nội dung 1: Phân lập và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt 3.3.1.1 Phân lập vi khuẩn Xanthomonas spp. từ các mẫu bệnh Mục tiêu: Phân lập được những dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây hoa hồng lửa và cây ớt phục vụ cho các thí nghiệm khảo sát khả năng lây nhiễm, định danh và đối kháng về sau. Phương pháp - Thu thập mẫu bệnh đốm lá vi khuẩn: Mẫu bệnh đốm lá vi khuẩn có triệu chứng bệnh điển hình (Lowell et al., 1991; Jones et al., 2004; 7
11. Agrios, 2006; Huang et al., 2013; Cúc & Thủy, 2014; Kyone et al., 2016) trên hai loại cây trồng là ớt (20 vườn) và hoa hồng lửa (20 vườn) tại tỉnh Đồng Tháp (Burgess et al., 2009). - Phân lập vi khuẩn gây bệnh: dòng dịch vi khuẩn ứa ra từ mẫu bệnh được cấy lên đĩa petri chứa môi trường King's B theo Thước (2007). Các bước phân lập theo phương pháp của Burgess et al. (2009); Kyeon et al. (2016). Trữ giống ở điều kiện lạnh sâu (–200C), có kết hợp glycerol vô trùng 30% (Araújo et al., 2012; Kyeon et al., 2016). - Đặt tên vi khuẩn: Ký tự chữ là viết tắt chi vi khuẩn và đối tượng cây chủ, ký hiệu số là chỉ số dòng thu thập được từ 1 đến 20. 3.3.1.2 Khảo sát khả năng gây bệnh trên các cây trồng đã chọn của các dòng Xanthomonas spp. gây bệnh Mục tiêu: Đánh giá được khả năng lây nhiễm lên cây chủ của các dòng vi khuẩn gây bệnh tương ứng. Chọn lọc được dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh cao nhất, trung bình và thấp nhất, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Phương pháp: Trên 2 đối tượng cây chủ là cây hoa hồng lửa và cây ớt tương ứng với 2 thí nghiệm. Trên mỗi thí nghiệm, bố trí ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại với 21 nghiệm thức, với mỗi lần lặp lại trên 4 cây (đối với cây hoa hồng) và trên 10 cây (đối với cây cây ớt). Bao gồm: - NT 1: Không lây nhiễm bệnh. - NT 2 đến 21: Xử lý lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh được phân lập riêng lẻ từ dòng 1 đến dòng 20. Ghi nhận chỉ tiêu: Mức độ bệnh qua 16 ngày sau lây nhiễm với tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh theo QCVN 01– 38: 2010/BNNPTNT, (IRRI, 2002; Sharma, 2004); Chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian AUDPC được tính theo Jeger &Viljanen-Rollinson (2001). 3.3.1.3 Xác định danh pháp vi khuẩn Xanthomonas spp. dựa vào hình thái và phương pháp sinh hóa 8
12. Mục tiêu: Xác định được tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt. a) Xác định ba dòng XP17, XP7, XP1 (gây bệnh đốm lá trên cây ớt) theo các xét nghiệm sinh hóa Phương pháp: Tiến hành nuôi cấy và khảo sát ba dòng XP17, XP7, XP1 theo các chỉ tiêu sinh hóa như: Phản ứng Gram, hoạt tính catalase (Schaad et al., 2001; Kyeon et al., 2016). Ghi nhận chỉ tiêu: Ghi nhận các kết quả như khuẩn lạc có màu vàng; phản ứng Gram (–) âm tính; Cho hoạt tính catalase (+) dương tính. b) Xác định danh pháp ba dòng XR13, XR9, XR18 (gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng) theo phương pháp MALDI-TOF-MS Phương pháp: Ba dòng vi khuẩn được nuôi cấy, các bước xét nghiệm theo Strejcek et al. (2018); Ribeiro et al. (2019). Khối phổ được phân tích qua máy Biotyper (Bruker Daltonics, Đức). Kết quả thể hiện qua giá trị điểm (score value - SV) từ 0 đến 3, với SV< 1,7 là chưa xác định được danh pháp; SV từ 1,7 - 2,0 được xem là có thể xác định chi, SV từ 2,0 - 2,3 là xác định được chi và có thể về loài, SV≥ 2,3 là có thể xác định chắc chắn về chi và loài. Ghi nhận chỉ tiêu: kết quả được đánh giá qua hệ thống tự động, so sánh với hướng dẫn của hệ thống đến mức độ chi hoặc loài. c) Xác định danh pháp ba dòng XR13, XR9, XR18 (gây bệnh trên cây hoa hồng) theo kỹ thuật Phân tích trình tự đa locus (MLSA) Phương pháp - Các phân tích sáu gen housekeeping fusA, gap1, gltA, gyrB, lacF, và lepA (Ameida et al., 2010; Huang et al., 2013) của dòng XR13 có khả năng lây nhiễm bệnh cao nhất. - Chuẩn bị và giải trình tự các gen của XR13: Khuếch đại trình tự được chọn với các mồi PCR và các điều kiện khuếch đại theo Almeida et al. (2010). Sản phẩm khuếch đại được giải trình tự nhờ hệ thống BigDye 9
13. Terminator Cycle Sequencing Chemistry and ABI 3730 XL Sequencer (Applied Biosystems). - Xử lý trình tự các gen của XR13 được giải: Các chuỗi đã được canh chỉnh bằng BioEdit phiên bản 7.2.5, được so sánh với cơ sở dữ liệu trên Ngân hàng gen (NCBI) nhờ kỹ thuật BLASTn, và được gửi đăng ký accession number vào Ngân hàng Gen (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/). - Các dòng Xanthomonas spp. phục vụ so sánh được tải xuống từ hệ thống PAMDB.org (Ameida et al., 2010). Trình tự các gen của dòng Xanthomonas euvesicatoria pv. R07 và Stenotrophomonas maltophilia R551 được tải về từ hệ thống Genbank (NCBI). - Phân tích phát sinh loài trên chương trình MEGA X với phân tích neighbor-joining tree, kỹ thuật Maximum Composite Likelihood. Đánh giá ma trận tương đồng theo kỹ thuật Distance/compute pairwise distances của MEGA X. Ghi nhận chỉ tiêu: Kết quả so sánh trên GenBank qua kỹ thuật BLAST được ghi nhận; Cây phát sinh loài, sự tương đồng giữa các loài thu được qua phân tích trên MEGA X. 3.3.2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có nguồn gốc từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp. gây bệnh đã được phân lập 3.3.2.1 Phân lập vi khuẩn Mục tiêu: Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng triển vọng đối với các dòng Xanthomonas spp. được chọn. Phương pháp: - Thu mẫu đất theo TCVN 5297:1995: (Mẫu đất, cơ chất từ vùng rễ của những cây có sự sinh trưởng tốt vượt trội, không có dấu hiệu bệnh; với VQG Tràm Chim -18 mẫu, Khu du lịch sinh thái Gáo Giồng - 9 mẫu, Khu di tích Xẻo Quýt - 9 mẫu). 10
14. - Phân lập theo Thước, (2007); Điệp & Hiệp (2011); Trữ giống ở điều kiện lạnh sâu (–200C) trong môi trường Nutrient Broth kết hợp glycerol vô trùng 30%. 3.3.2.2 Khảo sát khả năng đối kháng in vitro trước các dòng Xanthomonas spp. được chọn của những dòng vi khuẩn phân lập được từ mẫu đất Mục tiêu: Lựa chọn được những dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng trước Xanthomonas spp. gây bệnh được chọn. Phương pháp: Chuyển huyền phù vi khuẩn phân lập được (OD600 = 0,3) từ mẫu đất sang đĩa petri chứa mầm bệnh, đặt ở 280C trong 24 giờ (Li et al., 2006; 2008). Ghi nhận chỉ tiêu: đường kính vùng ức chế vi khuẩn. 3.3.2.3 Khảo sát mật độ đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng đối với Xanthomonas spp. XP17 và XR13 Mục tiêu: Xác định được mật độ vi khuẩn đối kháng tối thiểu có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Phương pháp: Các dòng BR16, BR37, BR88, G24, X61, T265 được thử nghiệm đối kháng Xanthomonas spp. XR13; Các dòng BP11, BP49, BP103, G24, T11, T188 được thử nghiệm đối kháng Xanthomonas spp. XP17. - Huyền phù ban đầu của Xanthomonas spp. là 2,7 x1013 CFU/mL (đối với XR13) và 4,4 x1013 CFU/mL (đối với XP17). Cùng với huyền phù của các vi khuẩn đối kháng triển vọng đều được pha loãng 10, 100, 1000 và 10000 lần. - Hút và nhỏ giọt 5 µL huyền phù vi khuẩn đối kháng vào đĩa petri đã chứa Xanthomonas spp. Các đĩa petri được giữ ở 28 ± 2oC trong 36 giờ. Ghi nhận chỉ tiêu: Đường kính vùng ức chế hình thành bởi vi khuẩn đối kháng chống lại Xanthomonas spp 11
15. 3.3.2.4 Định danh một số dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng a) Xác định danh pháp vi khuẩn đối kháng theo phương pháp MALDI- TOF-MS Mục tiêu: Các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được định danh đến mức độ chi hoặc loài theo kỹ thuật MALDI-TOF. Phương pháp: Các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng nhất được xác định với kỹ thuật MALDI-TOF-MS theo Strejcek et al. (2018); Ribeiro et al. (2019). Khối phổ được phân tích qua máy Biotyper (Bruker Daltonics, Đức). Ghi nhận chỉ tiêu: Ghi nhận kết quả được đánh giá qua hệ thống tự động. b) Danh pháp vi khuẩn được xác định các dòng vi khuẩn được chọn bằng sinh học phân tử Mục tiêu: Các dòng vi khuẩn triển vọng chưa xác định được qua MALDI-TOF-MS được xác định qua kỹ thuật sinh học phân tử. Phương pháp: Tách chiết DNA, khuếch đại gen 16S rRNA với cặp mồi chung 27F/1492R (Weisburg, 1991) và giải trình tự qua hệ thống ABI 3730 XL Sequencer; Các trình tự gen này được so sánh trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ BLAST-N, xác định tên của vi khuẩn và đăng ký “accession number” trong ngân hàng gen (NCBI). 3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng Mục tiêu: Đánh giá được hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá trên cây hoa hồng lửa, ớt của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng. Phương pháp: Gồm 4 thí nghiệm, tương ứng nhóm vi khuẩn đối kháng và các dòng Xanthomonas spp. được chọn (Bảng 3.3). 12
16. Bảng 3.3: Các thí nghiệm khảo sát khả năng kiểm soát bệnh trong điều kiện nhà lưới T cây Xử lý vi khuẩn đối kháng Xử lý lây nhiễm bệnh N chủ BR16, BP11, Ba dòng vi khuẩn XR13, XP17, BR37, BP49, đối kháng triển XR9, XP7, BR88 BP103 vọng từ vùng sinh XR18 XP1 thái bản địa 1 hồng + - - + - 2 hồng - - + + - 3 ớt - + - - + 4 ớt - - + - + Ghi chú: +: Có xử lý; -: Không xử lý Trên mỗi thí nghiệm, bố trí ngẫu nhiên, gồm 7 nghiệm thức (NT), với 3 lặp lại, mỗi lặp lại trên 4 cây (hồng), và 10 cây (ớt). Cụ thể: NT 1: Không xử lý vi khuẩn đối kháng hoặc lây bệnh; NT 2, 3, 4: Không xử lý vi khuẩn đối kháng và có lây bệnh nhân tạo với một trong ba dòng Xanthomonas spp. được chọn; NT 5, 6, 7: Lá được phun với một trong ba dòng vi khuẩn đối kháng được chọn với mật độ 107 CFU/mL, được phun trước 48 giờ lây bệnh nhân tạo với một trong ba dòng Xanthomonas spp. được chọn (108 CFU/mL). Ghi nhận chỉ tiêu: Mức độ bệnh qua 16 ngày sau lây nhiễm với tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh theo QCVN 01– 38: 2010/BNNPTNT, (IRRI, 2002; Sharma, 2004); Chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian AUDPC được tính theo Jeger &Viljanen-Rollinson (2001); Hiệu quả giảm bệnh theo Abbott (1925). 3.3.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của những dòng vi khuẩn kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn ở điều kiện ngoài đồng Mục tiêu: Đánh giá được hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn của các dòng đối kháng triển vọng ở điều kiện ngoài đồng. 13
17. Phương pháp: Gồm 4 thí nghiệm, tương ứng nhóm vi khuẩn đối kháng và các dòng Xanthomonas spp. được chọn (Bảng 3.4). Bảng 3.4: Các thí nghiệm khảo sát khả năng kiểm soát bệnh ở điều kiện ngoài đồng TN cây Xử lý vi khuẩn đối kháng Xử lý lây nhiễm bệnh chủ BR16, BP11, Ba dòng vi khuẩn XR13, XP17, BR37, BP49, đối kháng triển XR9, XP7, BR88 BP103 vọng từ vùng sinh XR18 XP1 thái bản địa 1 hồng + - - + - 2 hồng - - + + - 3 ớt - + - - + 4 ớt - - + - + Ghi chú: +: Có xử lý; -: Không xử lý Trên mỗi thí nghiệm, bố trí ngẫu nhiên, gồm 7 nghiệm thức, với 3 lặp lại, mỗi lặp lại trên 4 cây (hồng), và 10 cây (ớt). Cụ thể: – NT 1: Không xử lý vi khuẩn đối kháng hoặc lây bệnh. – NT 2, 3, 4: Không xử lý vi khuẩn đối kháng và có lây bệnh nhân tạo với một trong ba dòng Xanthomonas spp. được chọn. – NT 5, 6, 7: Lá được phun với một trong ba dòng vi khuẩn đối kháng, với mật độ 107 CFU/mL, trước 48 giờ lây bệnh nhân tạo với một trong ba dòng Xanthomonas spp. được chọn (108 CFU/mL). Ghi nhận chỉ tiêu: Mức độ bệnh qua 16 ngày sau lây nhiễm với tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh theo QCVN 01– 38: 2010/BNNPTNT, (IRRI, 2002; Sharma, 2004); Chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian AUDPC được tính theo Jeger &Viljanen-Rollinson (2001); Hiệu quả giảm bệnh theo Abbott (1925). 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel; phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 16.1 với phép thử Tukey’s ở mức ý nghĩa 5%. 14
18. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nội dung 1: Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá 4.1.1 Phân lập và xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây hoa hồng tại tỉnh Đồng Tháp 4.1.1.1 Phân lập dòng Xanthomonas spp. trên cây hoa hồng Phân lập được 20 dòng vi khuẩn từ mẫu bệnh với các triệu chứng điển hình của bệnh đốm lá do vi khuẩn (hình 4.1), lần lượt được đặt tên từ XR1 đến XR20. Hình 4.1: Triệu chứng bệnh đốm lá vi khuẩn trên Rosa spp. và khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh. A: Triệu chứng tự nhiên; B: Vi khuẩn rỉ ra từ vị trí cắt ngang của lá bị nhiễm bệnh; C: Khuẩn lạc của mầm bệnh được ria trên môi trường King’s B; D: Khuẩn lạc ở 36 giờ nuôi cấy; E: Khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy. 4.1.1.2 Khảo sát khả năng gây bệnh trên cây hoa hồng của các dòng Xanthomonas spp. được phân lập Ở điều kiện nhà lưới, tất cả 20 dòng Xanthomonas spp. đều có khả năng bệnh trên cây hoa hồng với triệu chứng bệnh được ghi nhận rõ sau 4 ngày sau khi lây nhiễm (NSKLN). Bệnh phát triển trong giai đoạn 4 đến 8 NSKLN, sau đó, tiến triển chậm lại. Tại 16 NSKLN, dòng XR13 có khả năng gây hại cao nhất, XR18 gây hại thấp nhất so với tất cả các dòng gây bệnh, và dòng XR9 gây hại 15
19. ở mức độ trung bình. Các dòng XR13, XR18, XR9 được chọn nhằm phục vụ các nghiên cứu tiếp theo (Hình 4.4; 4.5). Hình 4.4: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ bệnh (A), chỉ số bệnh (B), chỉ số AUDPC (C) từ các dòng Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới. Hình 4.5: Khả năng gây bệnh của ba dòng vi khuẩn (XR9, XR13, XR18) gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới. 16
20. A: Nghiệm thức (NT) đối chứng không lây bệnh; B: NT lây bệnh dòng XR9; C: NT lây bệnh dòng XR13; D: NT lây bệnh dòng XR18. Các nghiệm thức B, C, D có lá bị rụng nhiều 4.1.1.3. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo phương pháp MALDI-TOF-MS Ba dòng XR9, XR13 và XR18 được ghi nhận có sự trùng khớp với các loài thuộc chi Xanthomonas, với giá trị điểm của chúng đều cao hơn 2,00 và nhỏ hơn 2,3, đều là chi Xanthomonas, và chưa có sự chắc chắn về loài (Bảng 4.3). Bảng 4.3: Danh pháp ba dòng Xanthomonas spp. (XR9, XR13, XR18) dựa vào kỹ thuật MALDI-TOF-MS Giá trị Giá trị Tên phân Dòng Dòng vi sinh vật Dòng vi sinh vật điểm điểm tích VK (phù hợp nhất) (phù hợp thứ hai) (SV) (SV) C10( ++ ) XR13 Xanthomonas 2.042 Xanthomonas 1.942 axonopodis perforans C11( ++ ) XR18 Xanthomonas 2.002 Xanthomonas 1.999 axonopodis perforans C12( ++ ) XR9 Xanthomonas 2.12 Xanthomonas 2.037 axonopodis perforans (+): Ký hiệu thể hiện giá trị điểm từ 1,700 đến 1,999 tương ứng có thể xác định đến chi, (++): Ký hiệu thể hiện giá trị điểm từ 2,000 đến 2,299, tương ứng xác định chính xác chi và có thể xác định đến loài; SV: giá trị điểm (Score value). 4.1.1.4. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng theo kỹ thuật Phân tích trình tự đa locus (MultiLocus Sequence Analysis – MLSA) Trình tự sáu gen của Xanthomonas sp. XR13 được đăng ký “accession number” trên hệ thống Banklt thuộc Genbank (NCBI) lần lượt là OK044140 (fusA), OK044141 (gap1), OK044142 (glta), OK044143 (gyrb), OK044144 (lacf), OK044145 (lepA). BLASTN từng gen trên Genbank (NCBI) đã ghi nhận các loài X. perforans CP019725, CP018475, X. axonopodis pv. citrumelo CP002914, X. axonopodis pv. commiforeae CP031059, X. euvesicatoria 17
21. pv. alfalfae CP072268, X. euvesicatoria pv. rosa R07 có sự tương đồng cao với dòng XR13. Dòng XR13 với trình tự nối (2.692 bp) có phát sinh loài cùng nhánh, gần gũi với các loài X. euvesicatoria pv. rosa R07 có nguồn gốc từ Hoa Kỳ (Huang et al., 2013; Barak et al., 2016), X. perforans ICMP16690, X. euvesicatoria ICPB10461, X. citri pv. malvacearum ICPB1053, X. axonopodis pv. manihotis LMG784 từ hệ thống PAMDB.org (Almeida et al., 2010). Khi phân tích giá trị tương đồng đã ghi nhận nhánh trên có giá trị tương đồng trong nhóm dao động từ 93,5% đến 98,6%. Trong đó, dòng Xanthomonas sp. XR13 có sự tương đồng cao nhất với X. euvesicatoria pv. rosa R07 với 98,6%, tiếp theo là X. euvesicatoria ICPB10461 (97,9%) và X. perforans ICMP16690 (97,6%). Qua phân tích MALDI-TOF-MS, MLSA, dòng XR13 gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng tại Làng hoa Sa Đéc tỉnh Đồng Tháp thuộc về chi Xanthomonas, được đề xuất là loài Xanthomonas euvesicatoria. 18
22. Hình 4.7: Phát sinh loài của dòng Xanthomonas sp. XR13 gây bệnh trên cây hoa hồng dựa trên trình tự nối của các gen fusA, gap-1, gltA, gyrB, lacF và lepA. 4.1.2 Phân lập và xác định danh pháp dòng vi khuẩn gây bệnh trên cây ớt (Capsicum spp.) tại tỉnh Đồng Tháp 4.1.2.1 Phân lập dòng Xanthomonas spp. gây bệnh trên cây ớt 20 dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu bệnh với các triệu chứng điển hình của bệnh đốm lá do vi khuẩn (hình 4.8), và được đặt tên lần lượt từ XP1 đến XP20. 19
23. Hình 4.8: Đặc điểm của vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên Capsicum spp. và khuẩn lạc vi khuẩn gây bệnh. A: Triệu chứng tự nhiên của bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt; B: Dòng chảy vi khuẩn từ vết cắt ngang mẫu bệnh; C: Cấy ria vi khuẩn gây bệnh dòng XP18; D: Khuẩn lạc vi khuẩn có vòng nhẫn sau 4-5 ngày nuôi cấy. 4.1.2.2 Khảo sát khả năng gây bệnh trên cây ớt của các dòng Xanthomonas spp. được phân lập Ở điều kiện nhà lưới, 20 dòng Xanthomonas spp. đều có khả năng gây bệnh trên cây ớt với triệu chứng bệnh được ghi nhận rõ sau 4 NSKLN. Bệnh phát triển trong giai đoạn 4 đến 8 NSKLN, sau đó, tiến triển chậm lại. Tại 16 NSKLN, XP17 có khả năng gây hại cao nhất, XP1 có gây hại thấp nhất, và XP7 có gây hại ở mức độ trung bình so với tất cả các dòng gây bệnh (Hình 4.11; 4.12). Các dòng XP1, XP7, XP17 được lựa chọn phục vụ cho việc tuyển chọn vi khuẩn đối kháng trong điều kiện in vitro, nhà lưới và ngoài đồng. 20
24. Hình 4.11: Biểu đồ hộp thể hiện tỷ lệ bệnh (A), chỉ số bệnh (B), chỉ số AUDPC (C) từ các dòng Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây ớt trong điều kiện nhà lưới. Hình 4.12: Khả năng gây bệnh của ba dòng vi khuẩn (XP1, XP7, XP17) gây bệnh đốm lá trên cây ớt trong điều kiện nhà lưới. A: Nghiệm thức đối chứng không lây nhiễm bệnh; B: NT lây nhiễm dòng XP1; C: NT lây nhiễm dòng XP7; D: NT lây nhiễm dòng XP17; Các nghiệm thức B, C, D lá bị rụng nhiều, đặc biệt nghiệm thức D. 4.1.1.3. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây ớt theo hình thái, sinh hóa. 21
25. Ba dòng XP1, XP7, và XP17 có triệu chứng bệnh điển hình khi lây bệnh nhân tạo như tạo các đốm nhỏ, ngấm nước, (Hình 4.13, mục D, E, F), có thể kết hợp lại và gây ra vết hoại tử lớn làm lá chuyển sang màu vàng và rụng sớm. Các đặc điểm này tương tự với các triệu chứng được ghi nhận trên đồng ruộng. Các dòng XP1, XP7, XP17 có phản ứng Gram âm (–); màu vàng trên nutrient agar, và có hoạt tính catalase dương tính (+). Kết quả này thể hiện các dòng vi khuẩn này thuộc chi Xanthomonas (Schaad, 2001). 4.2 Nội dung 2: Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng đối kháng với Xanthomonas spp. được phân lập từ cơ chất vùng rễ và đất vùng sinh thái bản địa 4.2.1 Phân lập vi khuẩn Từ 20 mẫu cơ chất vùng rễ cây hoa hồng phân lập được 203 dòng vi khuẩn và được đánh số thứ tự từ BR1 đến BR203; Bên cạnh đó, 253 dòng vi khuẩn vùng rễ trồng cây ớt đã được phân lập, được đánh số ký hiệu từ BP1 đến BP253. Từ 36 mẫu đất tại ba vùng sinh thái bản địa tỉnh Đồng Tháp, 543 dòng vi khuẩn đã được phân lập, bao gồm 303 dòng vi khuẩn từ Tràm Chim (từ T1 đến T303), 138 dòng vi khuẩn từ Gáo Giồng (từ G1 đến G138) và 102 dòng vi khuẩn từ Xẻo Quýt (X1 đến X102). 4.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng các dòng Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trong điều kiện in vitro Từ 203 dòng vi khuẩn vùng rễ cây hoa hồng, 14 dòng vi khuẩn thể hiện sự đối kháng triển vọng với cả ba dòng gây bệnh. Trong đó, với ba dòng BR16, BR37 và BR88 có khả năng đối kháng cao nhất (hình 4.11; 4.12). Từ 543 dòng được phân lập từ các vùng sinh thái, 131 dòng vi khuẩn được ghi nhận có khả năng ức chế ít nhất một trong ba dòng Xanthomonas spp Trong đó, 3 dòng T265 (từ Tràm Chim), G24 (Gáo Giồng), X61 (Xẻo Quýt) có khả năng đối kháng cao nhất (hình 4.11). 22
26. Hình 4.14: Biểu đồ thể hiện khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn vùng rễ và vùng sinh thái bản địa đối với ba dòng XR13, XR9, XR18. Hình 4.15: Hiệu quả của các dòng vi khuẩn đối kháng (BR16, BR37, BR88) đối với ba dòng Xanthomonas spp. gây bệnh trên cây hoa hồng. A: Đối kháng đối với dòng XR13; B: Đối kháng đối với dòng XR9; C: Đối kháng đối với dòng XR18; a: Đối chứng với giấy thấm dung dịch oxolinic acid 20%; b: Đối chứng sử dụng môi trường nutrient broth được khử trùng; c: Giấy thấm huyền phù dòng BR16; d: Giấy thấm huyền phù dòng BR37; e: Giấy thấm huyền phù dòng BR88; f: Giấy thấm huyền phù dòng BR51. 4.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn đối kháng các dòng Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điều kiện in vitro Từ 253 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ trồng cây, 14 dòng vi khuẩn thể hiện sự đối kháng triển vọng với cả ba dòng gây bệnh. Trong đó, ba dòng dòng BP103, BP11 và BP49 thể hiện khả năng đối kháng cao nhất (Hình 4.18). Từ 543 dòng vi khuẩn được phân lập vùng sinh thái bản địa, 13 dòng vi khuẩn đều ghi nhận khả năng đối kháng cao ức chế cả 3 dòng XP17. XP7, XP1. Trong đó, 3 dòng T11, T188 (Tràm Chim), G24 (Gáo Giồng) đạt khả năng đối kháng cao nhất (hình 4.18). 4.2.4 Xác định các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng 23
27. Dựa vào kỹ thuật phân tích MALDI-TOF-MS, đa số các dòng vi khuẩn đối kháng đều xác định được chi như: các dòng BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24 đều thuộc chi Bacillus, dòng T11 thuộc về chi Enterobacter, dòng X16 thuộc chi Serratia. Trong đó, các dòng BP49, X61 được xác định đến loài là B. subtilis. Ngoài ra, dòng T265 chưa được xác định được chi. Các dòng BR16, BR37, BR88, T265, G24, BP103 tiếp tục được phân tích trình tự gen 16S rRNA và đăng ký “accession number”. Nhìn chung, BR16 được đề nghị là B. velezensis MW677565; trong khi dòng BR37 là B. subtilis MW828613; dòng BR88 tương ứng là B. amyloliquefaciens MW828656; BP103 được đề xuất là Bacillus velezensis OM017175; T265 được chỉ định là Paenibacillus elgii MZ841643, trong khi dòng G24 là B. subtilis MZ841644. 4.2.5 Khảo sát mật độ đối kháng của các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng đối với Xanthomonas spp. XP17 và XR13 Khi giảm mật độ các dòng XP17, XR13 xuống đã làm xuất hiện và tăng khả năng ức chế của các dòng vi khuẩn đối kháng. Tuy nhiên, khi các dòng vi khuẩn đối kháng với quần thể nhỏ hơn 106 CFU/mL đều không hiệu quả hoặc hiệu quả rất thấp trong việc hình thành vùng ức chế vi khuẩn gây bệnh, có thể không hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh trong điều kiện ngoài nhà lưới, ngoài đồng. Do đó, mật độ khoảng 107 CFU/mL được lựa chọn làm mật độ để xử lý trong thử nghiệm trên cây hoa hồng, cây ớt ở điều kiện nhà lưới, ngoài đồng. 4.3 Nội dung 3: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trong điều kiện nhà lưới của những dòng vi khuẩn triển vọng 4.3.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trong điều kiện nhà lưới Kết quả phân tích ghi nhận các dòng vi khuẩn đối kháng đều đạt hiệu quả kiểm soát bệnh, giúp giảm bệnh rất nhiều. Riêng dòng BR88 có khả năng kiểm soát bệnh cao hơn so với hai dòng vi khuẩn đối kháng 24
28. BR16, BR37, đặc biệt khi lây nhiễm dòng XR18. Vì thế, ba dòng này có thể được lựa chọn xử lý tiếp tục thử nghiệm ngoài đồng. Trong khi đó, dòng G24 có khả năng kiểm soát bệnh vượt trội so với hai dòng vi khuẩn đối kháng X61, T265. Vì thế, ba dòng này có thể được lựa chọn xử lý tiếp tục thử nghiệm ngoài đồng. Hình 4.26: Hiệu quả kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn đối kháng đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng sau 16 NSKLN. A: Nghiệm thức lây nhiễm dòng XR13; B: NT lây nhiễm dòng XR9; C: NT lây nhiễm dòng XR18; D: NT xử lý dòng BR88 trước khi lây nhiễm dòng XR13; E: NT xử lý dòng BR88 trước khi lây nhiễm dòng XR9; F: NT xử lý dòng BR88 trước khi lây nhiễm dòng XR18; G: NT xử lý dòng G24 trước khi lây nhiễm dòng XR13; H: NT xử lý dòng G24 trước khi lây nhiễm dòng XR9; I: NT xử lý dòng G24 trước khi lây nhiễm dòng XR18. Các nghiệm thức A, B, và C nhiễm bệnh với mức độ bệnh cao hơn, thể hiện qua tán lá bị nhiễm bệnh và rụng đi nhiều. Trong khi, các nghiệm thức D, E, F, G, H, I có xử lý vi khuẩn đối kháng, có có hiệu quả giảm bệnh cao thể hiện qua tán lá phát triển tốt. 25
29. 4.3.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điều kiện nhà lưới Kết quả ghi nhận khi có lây nhiễm bệnh, cả ba dòng vi khuẩn đối kháng đều đạt hiệu quả kiểm soát bệnh. Riêng dòng BP103 có khả năng kiểm soát bệnh cao hơn so với hai dòng vi khuẩn đối kháng BP11, BP49, đặc biệt khi lây nhiễm dòng XP17 hoặc XP1. Trong khi dòng G24 có khả năng kiểm soát bệnh vượt trội so với hai dòng vi khuẩn đối kháng T11, T188. Vì thế, các dòng vi khuẩn đối kháng này có thể được lựa chọn xử lý tiếp tục thử nghiệm ngoài đồng. Hình 4.28: Hiệu quả kiểm soát bệnh của vi khuẩn đối kháng triển vọng (BP103) đối với bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt sau 16 NSKLN. A: Nghiệm thức lây nhiễm dòng XP17; B: NT lây nhiễm dòng XP7; C: NT lây nhiễm dòng XP1; D: NT xử lý dòng BP103 trước khi lây nhiễm dòng XP17; E: NT xử lý dòng BP103 trước khi lây nhiễm dòng XP7; F: NT xử lý dòng BP103 trước khi lây nhiễm dòng XP1; G: NT xử lý dòng G24 trước khi lây nhiễm dòng XP17; H: NT xử lý dòng G24 trước khi lây nhiễm dòng XP7; I: NT xử lý dòng G24 trước khi lây nhiễm dòng XP1. 26
30. Các nghiệm thức A, B, và C nhiễm bệnh với mức độ bệnh cao hơn. Trong khi, các nghiệm thức D, E, F, G, H, I có xử lý vi khuẩn đối kháng, có hiệu quả giảm bệnh cao thể hiện qua tán lá phát triển tốt. 4.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng và cây ớt trong điều kiện ngoài đồng của các dòng vi khuẩn đối kháng 4.4.1 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây hoa hồng trong điều kiện ngoài đồng của các dòng vi khuẩn đối kháng Ở điều kiện ngoài đồng, các dòng vi khuẩn đối kháng đều đạt hiệu quả kiểm soát bệnh. Nghiệm thức có xử lý dòng BR16 hoặc BR88 đạt HQGB tương đương nhau về ý nghĩa thống kê tương ứng đạt 67%; 73,2% (khi lây nhiễm XR9), và 66,2%; 71,9% (khi lây nhiễm XR18), và cao hơn 1,2 đến 1,4 lần so với nghiệm thức xử lý BR37. Như vậy, xử lý dòng BR88 (B. amyloliquefaciens MW828656) vẫn đạt hiệu quả giảm bệnh tương đương với dòng BR16 (B. velezensis MW677565), và cao hơn dòng BR37. Bên cạnh đó, kết quả phân tích hiệu quả giảm bệnh khi xử lý dòng X61 hoặc T265 cho thấy các dòng này có hiệu quả tương đương nhau về ý nghĩa thống kê, tương ứng từ 62,8% đến 65,2% (khi lây nhiễm dòng XR13), từ 58,3% đến 60,8% (khi lây nhiễm dòng XR9), và khi lây nhiễm dòng XR18 thì hiệu quả giảm bệnh dao động từ 60,5% đến 62,2%. Trong khi, nghiệm thức có xử lý dòng G24 (B. subtilis) thể hiện hiệu quả giảm bệnh cao nhất so với hai dòng X61, T265, với hiệu quả giảm bệnh lần lượt đạt 74,5%, 75,7%, 75,6% tương ứng khi lây nhiễm các dòng XR13, XR9, XR18. 4.4.2 Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm lá vi khuẩn trên cây ớt trong điều kiện ngoài đồng của các dòng vi khuẩn đối kháng Ở điều kiện ngoài đồng, ba dòng BP11 (Bacillus sp.), BP49 (B. subtilis), BP103 (Bacillus velezensis) được đánh giá hiệu quả giảm bệnh, kết quả ghi nhận cả BP11, BP49, BP103 đều có khả năng hạn chế sự gây 27
31. hại từ cả ba dòng Xanthomonas spp. XP17, XP7, XP1. Trong đó, các nghiệm thức có xử lý dòng BP11 hoặc BP49 đạt HQGB tương đương nhau tương ứng đạt 61,8%, 54,1% (LNB XP17), và 66,8%, 63,6% (LNB XP7), 61,3%, 58,8% (LNB XP1) và cao hơn 1,2 đến 1,4 lần so với nghiệm thức xử lý BP103 (tương ứng 73,2%, 78,4%, 76,1%). Như vậy, ở điều kiện ngoài đồng, xử lý dòng BP103 đạt hiệu quả giảm bệnh cao nhất. Trong khi đó, cả ba dòng G24, T11, T188 đều có khả năng hạn chế sự gây hại từ cả ba dòng Xanthomonas spp., với dòng T11 hoặc T188 được ghi nhận có hiệu quả tương đương nhau. Bên cạnh đó, nghiệm thức có xử lý dòng G24 thể hiện hiệu quả giảm bệnh cao nhất và so với hai dòng T11 và T188, với hiệu quả giảm bệnh lần lượt đạt 79,8%, 75,8%, 75,3% tương ứng khi lây nhiễm các dòng XP17, XP7, XP1. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Luận án đã ghi nhận dòng Xanthomonas euvesicatoria là tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây hoa hồng qua phân tích MALDI-TOF-MS và MLSA; Trong khi đó, xác định Xanthomonas spp. gây bệnh đốm lá trên cây ớt dựa trên đặc điểm sinh hóa. Qua sàng lọc in vitro, kết quả ghi nhận ba dòng BR16, BR37, BR88 (từ cơ chất vùng rễ cây hoa hồng) và ba dòng T265, X61, G24 (từ đất vùng sinh thái bản địa) thể hiện sự đối kháng triển vọng với ba dòng Xanthomonas euvesicatoria (XR13, XR9, XR18) gây bệnh trên cây hoa hồng. Đồng thời, ba dòng BP11, BP49, BP103 (từ đất vùng rễ cây ớt) và G24, T11, T188 (từ đất vùng sinh thái bản địa) có khả năng đối kháng triển vọng đối với ba dòng Xanthomonas spp. (XP17, XP7, XP1) gây bệnh trên cây ớt. Các dòng vi khuẩn đối kháng triển vọng được xác định qua kỹ thuật phân tích MALDI-TOF-MS, các dòng BP49, X61 được xác định đến loài B. subtilis, và ghi nhận các dòng BR16, BR37, BR88, BP11, BP49, BP103, X32, X61, G24 thuộc chi Bacillus, dòng T11 thuộc về chi 28
32. Enterobacter, dòng X16 thuộc chi Serratia. Một số dòng được tiếp tục xác định qua phân tích sinh học phân tử và đăng ký “accession number” là các loài B. velezensis MW677565 (BR16), B. subtilis MW828613 (BR37), B. amyloliquefaciens MW828656 (BR88), B. velezensis OM017175 (BP103), Paenibacillus elgii MZ841643 (T265), B. subtilis MZ841644 (G24). Ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng, B. amyloliquefaciens MW828656 (BR88) và B. velezensis OM017175 (BP103) được ghi nhận hiệu quả kiểm soát bệnh cao nhất trên đối tượng cây chủ tương ứng, và đặc biệt là B. subtilis MZ841644 (G24) phân lập từ đất vùng sinh thái bản địa đạt hiệu quả kiểm soát bệnh cao nhất trên cả hai loại cây chủ. Các dòng vi khuẩn này có thể được sử dụng như tác nhân sinh học phòng trị bệnh đốm lá trên cây hoa hồng và cây ớt. 5.2 Đề xuất Trong tương lai, sự đa dạng di truyền của tất cả các dòng vi khuẩn đã được phân lập, cũng như xác định phân dòng (race) có thể tiếp tục được xác định. Ngoài ra, với những tiềm năng kiểm soát bệnh của các dòng vi khuẩn được phân lập, trong tương lai có thể hướng đến nghiên cứu phối hợp các dòng này trong việc kiểm soát mầm bệnh đốm lá trên cây trồng. 29